2. 海军军医大学(第二军医大学)第二附属医院肛肠外科, 上海 200003;
3. 海军军医大学(第二军医大学)第二附属医院药剂科, 上海 200003
2. Department of Colorectal Surgery, The Second Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), Shanghai 200003, China;
3. Department of Pharmacy, The Second Affiliated Hospital of Naval Medical University (Second Military Medical University), Shanghai 200003, China
卡培他滨是治疗结直肠癌(colorectal cancer,CRC)的一线化疗药物,能显著提高CRC的总生存率[1]。但是,由于卡培他滨具有广谱细胞毒性,可导致肝毒性不良反应的发生,其临床表现为乏力、恶心、厌食等,严重者可出现肝硬化、肝纤维化、凝血障碍和肝性脑病等症状[2-3]。化疗所致肝毒性的发生不仅会影响CRC患者的生活质量,还会降低患者的用药依从性,从而限制患者从化疗中获益。
为了预防卡培他滨化疗过程中出现的肝毒性,临床上亟需可靠有效的生物标志物,以帮助早期识别出肝毒性易感患者,进而针对易感人群制定个体化的精准化疗方案。代谢组学是一种直接与临床表型相关的组学技术。相较于基因组学与表观遗传组学,代谢组学能够提供更准确的易感标志物,已作为一种全新的、整体的技术手段广泛应用于临床和生物医学研究[4]。已发现的肝毒性代谢标志物主要来自患者用药后的研究[5],无法直接体现出肝毒性风险患者的易感因素。本研究采用生物信息学方法,通过分析CRC患者接受卡培他滨化疗前的血液代谢物,筛选肝毒性相关的内源性标志物,建立卡培他滨肝毒性的预测模型。
1 材料和方法 1.1 研究对象选择2018年6月至2018年12月在海军军医大学(第二军医大学)第二附属医院行CRC根治术的患者作为研究对象。纳入标准:(1)年龄≥18岁;(2)经活检病理诊断为CRC;(3)接受以卡培他滨为基础的术后辅助化疗。排除标准:术前使用任何抗肿瘤药物的患者。共63例患者入组,其中具有完整随访记录及获得血浆样本的50例患者纳入最终分析。
本研究经海军军医大学(第二军医大学)第二附属医院伦理委员会批准(2016SL007),并在美国临床试验信息网站(www.clinicaltrials.gov)注册(NCT03030508)。
1.2 样本采集及肝毒性判断在患者术前1~2 d采集样本,采集样本之前获得患者书面知情同意。将5 mL血液样本置于EDTA抗凝管,离心(4 ℃,2 000×g,15 min)后收集血浆并分装于冻存管(400 μL/支),保存于-80 ℃冰箱待测。
在患者术后化疗开始后进行随访。由临床医师根据常见不良反应事件评价标准(common terminology criteria for adverse events,CTCAE)4.0版,通过每次化疗后的血液丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的含量变化,判定该化疗周期是否发生了肝毒性及其严重程度(分为0~4级)[6]。在整个疗程结束后(3~8个化疗周期),取所有肝毒性记录的最大值作为最终的不良反应指标。
1.3 非靶向代谢组学检测采用超高效液相色谱结合四极杆飞行时间质谱(ultra-high-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UHPLC-Q-TOF-MS)法进行非靶向代谢组学分析。检测试剂:乙腈(质谱级,德国Merck公司),甲酸(色谱级,德国Tedia公司)、异丙醇[色谱级,赛默飞世尔科技(中国)有限公司],甲酸胺(分析纯,美国Sigma-Aldrich公司),内参物为氘代黄酮(美国Avanti公司);质谱所用参比液、调谐液均为美国Agilent公司提供。
血液样本前处理:使用蛋白质沉淀法除去血浆样本中的大分子物质,将50 μL血浆与200 μL甲醇(含100 ng/mL金雀异黄酮D4)混合,涡旋2 min,4 ℃条件下1 200×g离心15 min,取200 μL上清液冷冻干燥12 h左右,加入100 μL 20%的甲醇水溶液复溶,取上清液置于进样小瓶中。
质控样品的制备:从每个研究样品中取等量体积(5 μL),混合均匀后制得质控样品。
色谱条件:使用美国Waters公司生产的色谱柱ACQUITY UPLC CSH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm)和预柱ACQUITY UPLC CSH C18(5 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱温设为65 ℃。流动相:A溶剂为60%乙腈水溶液(含10 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸),B溶剂为体积比90∶10的异丙醇∶乙腈溶液(含10 mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸)。进样量为5 μL。B溶剂起始浓度为5%,在6 min时增加到20%,9 min时增加到50%,13 min时增加到95%,15 min时增加到100%,然后再运行5 min;流速维持在0.4 mL/min。
质谱条件:采用电喷雾双喷电离检测模式,毛细管电压为3 500 V,气体温度为350 ℃,气体流量为11 L/min,雾化器压力为45 psi(310 kPa),质荷比(m/z)采集范围为100~1 700。串联质谱采集数据的时间间隔为0.33 s,碰撞能量分别为10、20和40 eV。使用参比液(m/z 121.050 9和m/z 922.009 8)校正采集过程中的质量漂移。
色谱-质谱分析方法学评价:为了消除由于长时间运行、环境变化等因素对质谱仪检测结果的潜在影响,采用质控样品对检测仪器进行质量控制[7]。在对研究样品进行分析前,先运行3次质控样品,每10个样品间运行1针质控样品以检测仪器的稳定性;每针洗脱程序的后5 min为冲洗,以降低进样针中的样品残留物。
1.4 数据分析及预测模型构建使用Profinder b8.0程序对采集的质谱数据进行分析,利用内参校正数据,通过提取递归特征获得含有保留时间(retention time,RT)、m/z和光谱面积的光谱特征列表,并去除由内标、噪声产生的光谱特征。再用Mass Profiler Professional软件对数据进行分析处理,根据80%规则剔除背景和非生物学相关信息,并使用内参进行数据归一化。
采用R 4.0.3软件进行代谢物筛选和预测模型构建,检验水准(α)为0.05。为排除年龄、性别等混杂因素对数据造成的潜在影响,使用limma函数包中的removeBatchEffect函数进行混杂因素校正。使用limma函数包实现差异分析。应用主成分分析(principal component analysis,PCA)检查数据分布,了解代谢轮廓。采用正交偏最小二乘判别分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)对聚类信息进行分析,可视化代谢变化。利用人类代谢组数据库(Human Metabolite Database,HMDB)对目标化合物的二级质谱离子进行鉴定,然后使用Reactome在线分析网站(https://reactome.org/)对差异化合物进行代谢通路富集分析。使用Hmisc函数包实现Pearson相关分析,并基于Gephi 0.9.2软件进行相关性网络可视化。使用createDataPartition函数将所有样本按照7∶3比例随机分成训练集和测试集,筛选潜在生物标志物;使用randomForest函数包进一步筛选重要标志物。使用pROC函数包进行ROC曲线分析,以评估模型的预测性能。
2 结果 2.1 临床资料本研究纳入的所有患者均接受卡培他滨+奥沙利铂(XELOX)方案术后化疗。根据CTCAE 4.0标准,50例患者中16例CTCAE 4.0分级为1~3级,归入肝毒性组;34例CTCAE 4.0分级为0级,归入对照组。肝毒性组中,男10例、女6例,年龄<60岁10例、≥60岁6例,BMI<24 kg/m2 7例、≥24 kg/m2 9例;对照组中,男25例、女9例,年龄<60岁16例、≥60岁18例,BMI<24 kg/m2 22例、≥24 kg/m2 12例。
2.2 与肝毒性相关的内源性代谢物筛选通过对UHPLC-Q-TOF-MS检测数据进行差异分析,筛选出149个与肝毒性相关的化合物。根据HMDB中的化合物分类,这些化合物进一步划分为苯类10个、脂类及其类似物71个、核苷酸及其类似物2个、有机酸及其衍生物27个、有机氮化合物2个、有机氧化合物6个、有机杂环化合物13个、苯丙烷和聚酮类8个、其他化合物10个。
对UHPLC-Q-TOF-MS正离子和负离子模式下检测到的肝毒性相关差异化合物分别进行PCA和OPLS-DA分析。从PCA结果(图 1A、1B)可见,对照组和肝毒性组间区分较为明显;OPLS-DA分析(图 1C、1D)结果显示,对照组和肝毒性组可以明显区分。进一步获得二级离子碎片,与HMDB二级质谱数据库进行比对,确定肝毒性相关内源性代谢物。
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图 1 卡培他滨化疗肝毒性相关差异代谢物的PCA和OPLS-DA分析 Fig 1 PCA and OPLS-DA analyses of differential metabolites associated with capecitabine chemotherapy-related hepatotoxicity A: PCA plot (negative ion mode); B: PCA plot (positive ion mode); C: OPLS-DA plot (negative ion mode); D: OPLS-DA plot (positive ion mode). PCA: Principal component analysis; OPLS-DA: Orthogonal partial least squares discriminant analysis; PC: Principal component. |
2.3 与肝毒性相关的代谢通路分析
对鉴定出的卡培他滨化疗肝毒性相关内源性代谢物进行通路富集分析,结果显示血浆中与肝毒性相关的代谢通路主要涉及信号转导与脂质代谢两大类,大部分通路包含的化合物与肝毒性呈正相关。其中,磷酸化磷脂酶2通路、鞘脂代谢通路和鞘脂生物合成通路为最显著的3条代谢通路。见图 2。
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图 2 卡培他滨化疗肝毒性相关内源性差异代谢物的代谢通路富集分析 Fig 2 Pathway enrichment analysis of differentially expressed endogenous metabolites associated with capecitabine chemotherapy-related hepatotoxicity GLP-1: Glucagon-like peptide-1; SLC: Solute-carrier gene; GPCR: G protein-coupled receptor; PLC: Phospholipase C; PLA2: Phospholipase A2; PA: Phosphatidic acid; PC: Phosphatidylcholine; CL: Cardiolipin. |
2.4 肝毒性相关内源性代谢物的相关性分析
将上述代谢通路中富集到的肝毒性相关内源性代谢物进行Pearson相关分析,筛选出r≥0.4且P<0.05的代谢物,对相关性网络进行可视化(图 3),进一步筛选出与其他肝毒性相关内源性代谢物连接数量最多的10个化合物,作为预测肝毒性的候选生物标志物(表 1)。其中鞘氨醇-1-磷酸(sphingosine-1-phosphate,S1P)是与肝毒性相关性最强的重要内源性代谢物。
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图 3 卡培他滨化疗肝毒性相关内源性代谢物相关性网络图 Fig 3 Correlation network diagram of endogenous metabolites associated with capecitabine chemotherapy-related hepatotoxicity S1P: Sphingosine-1-phosphate; LPA: Lyso phosphatidic acid; PC: Phosphatidylcholine; PE: Phosphatidylethanolamine; Cer: Ceramide. |
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表 1 卡培他滨化疗肝毒性候选预测标志物信息 Tab 1 Information of candidate predictive metabolites for capecitabine chemotherapy-related hepatotoxicity |
2.5 卡培他滨化疗肝毒性预测模型的构建和验证
将样本通过随机抽样、随机森林重复1 000次,筛选最终预测标志物。在训练集中,基于MeanDecreaseAccuray参数,选取特征出现频数总排名中≥500次的代谢物,上述10个化合物均被筛选为最终候选预测标志物。基于多因素logistic回归模型,构建由这些标志物联合的卡培他滨化疗肝毒性预测模型,进行ROC曲线分析并在测试集中加以验证。结果显示该模型在训练集、测试集、整个数据集中的预测性能较好,AUC分别为0.946(95% CI 0.842~1.000)、0.920(95% CI 0.720~1.000)、0.912(95% CI 0.810~0.982),见图 4。
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图 4 卡培他滨化疗肝毒性预测模型的ROC曲线分析 Fig 4 ROC curve analysis of prediction model for capecitabine chemotherapy-related hepatotoxicity ROC: Receiver operating characteristic; AUC: Area under curve. |
3 讨论
卡培他滨对CRC复发和死亡风险有重要贡献,但其导致的肝毒性不良反应发生率高,危害严重,限制了其有效运用[2-3]。为了在临床实践中实现卡培他滨所致肝毒性的早期预防,迫切需要确定相关易感生物标志物,由此建立的模型是可以有效预测CRC患者化疗所致肝毒性的有用且廉价的方法。
代谢组学的研究对象是除了大分子物质、外源性物质及其代谢物之外的一系列低分子量(分子量<1 000)有机化合物[4, 8]。相较于基因组学、表观遗传组学,代谢组学生物标志物具有与最终的表型直接相关、能够全面反映易感因素影响的优势[4]。它不仅可以识别诊断和预测疾病的生物标志物,也可以作为一种发现生物过程主动驱动因素的技术[9]。此外,与需要细胞DNA才能检测到的基因标志物、DNA甲基化标志物相比,代谢组学生物标志物对样本的采集要求更低,更加易于临床应用。
CRC患者化疗前的代谢物水平可以反映机体生长分化功能、免疫功能,在预测化疗所致的不良反应中体现出一定的临床应用价值,这一点在我们先前的研究中得到了证实[10-11]。本研究从CRC化疗患者用药前的血浆内源性代谢物中筛选出一系列与肝毒性相关的预测标志物,发现其中绝大部分属于脂类或类脂类代谢物。通路富集分析结果显示磷酸化磷脂酶2通路、鞘脂代谢通路和鞘脂生物合成通路等脂类代谢通路是与肝毒性易感性密切相关的代谢通路。在此基础上,本研究利用筛选出的CRC化疗患者发生肝毒性的易感标志物,建立了卡培他滨化疗肝毒性预测模型。经ROC曲线分析,该模型在训练集、测试集及整个数据集中具有较高的AUC,模型整体上体现了较好的预测效果。
本研究最终筛选到的10个肝毒性易感标志物中,磷脂酰胆碱(35∶1)、棕榈酸、磷脂酰乙醇胺(36∶1)、肉豆蔻酸、花生四烯酸、神经酰胺和S1P等7个化合物均属于脂质内源性代谢物。其中磷脂酰胆碱(35∶1)、棕榈酸、肉豆蔻酸、花生四烯酸与肝毒性具有较强的正相关性,磷脂酰乙醇胺(36∶1)、神经酰胺和S1P则与肝毒性呈负相关。本研究的差异分析、相关性分析、随机森林结果均提示肝毒性易感患者具有脂质代谢紊乱的特征。脂类作为一种重要的代谢物,具有许多关键的细胞功能,是细胞膜、储能分子及细胞间和细胞内信号分子的主要结构和调节成分[12]。关于脂类代谢物在CRC的发生、发展的研究也日益增加[13-16],但尚未有关于其在化疗相关肝毒性中的研究。由于肝脏在脂质代谢过程中起着至关重要的作用,脂质代谢紊乱已被认为是肝毒性发病机制的潜在驱动因素。脂质稳态的变化可能导致细胞膜不稳定、脂质积聚、氧化应激和炎症反应的发生[17]。因此,我们推测机体脂类代谢紊乱的患者更容易在服用化疗药物之后引发肝毒性。
S1P是一种抗凋亡剂,能介导多种抗凋亡化合物的作用[18]。S1P也是一种已知的肝损伤标志物,与肝脏的功能障碍或疾病后恢复密切相关[19]。肝毒性易感患者中S1P含量的下降可能指示这类患者的肝细胞更容易凋亡,因此更易受到化疗药物毒性的影响,具有发生肝毒性的风险。
神经酰胺是具有生物活性的鞘脂,参与许多细胞过程,如细胞增殖和迁移、分化、自噬、凋亡、衰老和炎症[20-23]。神经酰胺可通过经鞘磷脂水解、经丝氨酸和棕榈酸酯合成两条途径生成,被认为是鞘脂代谢的中心枢纽,是细胞周期停滞和凋亡细胞死亡的有效诱导剂[22, 24]。肝毒性易感患者中神经酰胺含量的下降可能指示神经酰胺控制的程序性细胞凋亡不是肝细胞死亡最主要的直接原因,其具体机制有待进一步研究。
本研究还发现肝毒性易感患者具有炎症反应标志物升高的特征。炎症反应也是促进肝毒性发生的因素之一,是已知的肝毒性生物标志物。酪氨酸可以通过抑制巨噬细胞减轻炎症反应[25]。巨噬细胞是调节肝脏炎症进程的关键介质。在本研究中肝毒性易感患者血浆酪氨酸含量较低,这些患者可能具有较高的炎症反应水平。
本研究存在以下局限性:(1)本研究是一项单中心研究,样本量相对较小,可能存在选择偏向。(2)由于本研究纳入的发生2级以上肝毒性的患者有限,未对2级以上肝毒性建立独立的预测模型。在后续研究中,我们将基于来自多中心观察研究的更大数量的临床病例,优化检测方法、完善统计学方法,进一步降低系统误差,对预测模型进行验证和修订。此外,我们还将针对预测模型中发现的易感标志物建立定性定量的靶向检测方法,从而满足临床检测的需要,为最终完善卡培他滨精准药物治疗提供实用工具。
综上所述,本研究通过非靶向代谢组学对血浆样本中的内源性代谢物分析,筛选出10个与卡培他滨化疗肝毒性相关的内源性易感标志物,基于随机森林、logistic回归等算法构建的多个标志物联合的肝毒性预测模型具有较好的预测性能。筛选出的易感标志物提示机体生长分化功功能与免疫功能异常是CRC患者发生卡培他滨化疗肝毒性的潜在易感机制。
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