肾性贫血(RA)是慢性肾衰竭(CRF)时以血红蛋白(Hb)降低为主要表现的并发症,发生概率近100%。贫血程度一般随肾功能降低而加重,是导致CRF高病死率的首要因素。目前多采用人工重组血清促红细胞生成素(EPO)治疗,但EPO不能解决毒素所致的血细胞生成及存活障碍，且部分患者对EPO存在低反应或无反应，及高血压、高血黏度等药物不良反应。益肾保真方是我科治疗CRF的有效经验方,临床观察对RA有较好的治疗作用,本研究通过5/6肾大部切除建立CRF动物模型,探讨该方对RA的疗效及作用机制,为其推广应用和开发新药提供依据。 1 材料和方法 1.1 实验动物

7~8周龄清洁级SD大鼠58只,雌雄各半,体质量(200±20) g,由西安交通大学医学院实验动物中心提供,合格证号:SCXK(陕)2012-003。 1.2 药物制备 益肾保真方由仙灵脾15 g、黄芪30 g、当归12 g、莪术9 g、积雪草12 g、制大黄9 g组成,生药水煎、过滤、浓缩成所需浓度待用,由本科自制；尿毒清颗粒,5 g/包,广州康臣药业有限公司生产(生产批号20110114)。 1.3 模型制作、分组及给药

将SD大鼠适应性喂养1周,选取尿蛋白为阴性的58只作为观察对象,按数字随机原则分为正常组(n=10),模型组(n=12),益肾保真方高剂量组(n=12)、低剂量组(n=12)，尿毒清组(n=12)。于实验第2周,除正常组外，采用二步肾切除法制作5/6肾切除大鼠CRF模型^[1]。造模成功者为43只,具体为:正常组9只,模型组8只,益肾保真方高剂量组9只、低剂量组9只，尿毒清组8只。益肾保真方高、低剂量组和尿毒清组于实验第4周分别按46.5、15.6、2.5 g/(kg·d)剂量灌胃给药,每日1次,连续6周；正常组、模型组灌胃等剂量蒸馏水。 1.4 动物处理及观察 给药6周后,禁食12 h,

麻醉大鼠,经腹主静脉取血,检测血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、Hb、红细胞计数(RBC)、平均红细胞容积(MCV)及EPO含量；取肾皮质切片,苏木精-伊红(H-E)染色观察肾组织形态。 1.5 统计学处理

运用SPSS 13.0软件处理数据,数据用 x±s表示。计量资料比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验。检验水准(α)为0.05。 2 结 果

与正常组比较，模型组Hb、RBC、MCV、EPO均降低，而BUN、SCr升高(P<0.01)； 与模型组比较,高、低剂量益肾保真方组Hb、RBC、EPO均提高(P＜0.05),而BUN 、SCr均降低(P＜0.05)；与尿毒清组比较,两给药组Hb、RBC、EPO均升高(P＜0.05),而MCV、BUN、SCr组间差异无统计学意义(P＞0.05)；各指标在两给药组间差异均无统计学意义(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 各组大鼠Hb、RBC、MCV、EPO、BUN、SCr变化

表 1 各组大鼠Hb、RBC、MCV、EPO、BUN、SCr变化

肾组织病理结果表明，正常组肾小球未见异常,肾小管排列紧密,肾间质无扩张,无炎性细胞浸润(图 1A)；模型组大鼠肾小球面积增大,肾小球有核细胞数增多,系膜基质增生,系膜区面积扩大,肾间质增宽,纤维组织增多,肾小囊囊腔变窄、球囊粘连(图 1B)；各给药组病理改变较模型组轻,其中低剂量益肾保真方组上述病理改变最轻(部分结果见图 1C)。 3 讨 论

RA发生的主要原因为EPO缺乏, 由于不影响红细胞体积,大多表现为正细胞性贫血。 如果血清铁严重不足,CRF患者亦常表现为小细胞性贫血^[2]。 本研究结果显示益肾保真方能升高Hb、RBC,其作用强于尿毒清。模型组MCV低于正常组(P＜0.01),说明CRF大鼠存在着小细胞性贫血,而经益肾保真方治疗的RA大鼠 MCV无明显升高,说明该方无明显纠正铁代谢紊乱的作用。

成人90%以上的EPO由位于肾皮质的肾小管周围成纤维细胞和内皮细胞生成,通过与红系定向祖细胞表面的EPO受体结合而促进其增殖和分化。肾功能正常时,其分泌EPO潜力巨大,受贫血刺激分泌EPO水平可达正常的100倍以上,随着肾单位的减少,这种潜力逐渐削弱,直至EPO水平低于正常值,若有干预因素强刺激,残余肾单位仍有一定潜力^[3]。本实验结果显示,与模型组及尿毒清组比较,益肾保真方高、低剂量组EPO水平均升高(P＜0.01)，说明益肾保真方升高血清EPO作用优于尿毒清,推测其疗效机制可能是通过对残余肾单位强有力的刺激而实现的。

图 1 各组肾组织病理结果(H-E染色) A: 正常组; B: 模型组; C: 益肾保真方低剂量 [15.6 g/(kg·d)]组. Original magnification: ×200

临床发现部分患者存在EPO抵抗,亦有透析治疗的患者,尽管血中EPO水平恒定,红细胞生成率也明显增高,这些现象难以单独用EPO缺乏解释。随着EPO受体(EPOR)抑制学说的提出,目前认为氮质、尿素等毒素具有减少骨髓EPOR数量、降低EPOR与EPO的亲和系数、抑制EPOR介导的信号转导途径等作用^[4]。因此降低氮质潴留,减轻其对骨髓EPOR的抑制是EPO疗效的重要保证。

本实验结果显示,益肾保真方高、低剂量组SCr、BUN均低于模型组(P＜0.01),而与尿毒清组差异无统计学意义。说明益肾保真方能降低血BUN、SCr,保护肾功能,延缓肾衰竭的进展,其疗效与尿毒清相接近。推测该方改善贫血的机制可能与其降低氮质潴留、减轻毒素对红系定向祖细胞膜上EPOR的抑制、保证EPO-EPOR信号的正常转导有关。

中医认为RA的病机为本虚标实,以正虚为本,邪实为标,存在着虚、瘀、湿、浊四大病理机制。我们结合临床经验,总结出肾健脾、养血填精、化瘀降浊的益肾保真方。方中黄芪健脾益气,以资生血之源；当归养血活血,和黄芪同用阴生阳长,气旺血生；仙灵脾温肾助阳填精；莪术辛散温通,破血行气；制大黄活血降浊,使补而不滞。研究证明, 黄芪、大黄可稳定红细胞膜清除氧自由基,通过抗氧化作用延长红细胞寿命^{[5, 6]}；当归、仙灵脾可促进EPO的分泌,刺激红系祖细胞(CFU-E)的分化成熟^{[7, 8]}。分析获知该方通过温补脾肾可促进EPO的分泌,刺激CFU-E的分化成熟；益气生血,增加外周红细胞数；降浊解毒改善氮质血症,减轻毒素对造血的抑制,延长红细胞寿命。总之，该方能保护肾功能,在纠正贫血的同时,可减轻对肾的病理性损害,延缓CRF的进展。 4 利益冲突

所有作者声明本文不涉及任何利益冲突。