2018, Vol. 50
传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)是传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)引起的鸡的一种急性、高度接触性传染病，是严重危害养鸡业的重大传染病之一[1].IBV是一种变异性很强的冠状病毒，血清型众多，不同血清型之间缺乏交叉保护[2].IBV的蔓延对全球家禽业造成了严重的经济损失[3].IBV的N基因进化最为保守，且N蛋白是诱导机体免疫应答的重要免疫原蛋白.制备针对N蛋白的单克隆抗体，对于建立IBV快速诊断方法具有重要意义.
1 材料和方法 1.1 材料H120毒株(AV1511)购自中国兽医药品监察所；SPF种蛋购于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；3只6~8周龄的雌性BALB/c小鼠购自郑州大学实验动物中心；SP2/0细胞由本实验室保存；表达载体pGEX-6p-1、E.coli Transetta(DE3)均由实验室保存；IPTG、氯霉素和氨苄青霉素购自Solarbio公司；限制性核酸内切酶、T4 DNA连接酶购自Promega公司；HRP标记羊抗鸡、羊抗鼠IgG购自Abbkine公司；ECL发光液购自Beyotime公司.
1.2 IBV的扩繁将IBV种毒H120冻干粉用1 mL灭菌的PBS缓冲液溶解.种蛋孵化至10日龄，用照蛋器观察鸡胚发育情况并标出气室，避开大血管，在接近气室处标记接种部位，用1 mL注射器吸取病毒稀释液接种鸡胚(200 μL/枚)，石蜡封口，在孵化箱中孵育.在接毒48 h后收毒，收获鸡胚尿囊液.于4 ℃ 10 000 rpm离心15 min，收获上清液并用0.22 μm滤膜除菌，-80 ℃保存.
1.3 N蛋白的原核表达 1.3.1 构建pGEX-6p-1-N表达载体登陆NCBI，根据Genebank中已发表的IBV H120(accession number:FJ888351)的N基因序列，使用Primer5.0设计引物，在上、下游引物5’端分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，上游引物HP1序列为：CCGGAATTCATGGCGAGCGGTAAGAC，下游引物HP2序列为：CCGCTCGAGTTACAACTCATTCTCTCCAAG，引物由上海生工生物工程有限公司合成.提取尿囊液中的总RNA，以提取的总RNA为模板，Random Hexamer Primer为引物，反转录成cDNA.以cDNA为模板，扩增N基因.提取pGEX-6p-1质粒，将表达载体与上述纯化回收的PCR产物，使用EcoRⅠ和XhoⅠ进行双酶切.将双酶切后的PCR产物和pGEX-6p-1纯化回收，然后连接.
1.3.2 N蛋白的表达及纯化将连接后的重组质粒pGEX-6p-1-N转化入100 μL E.coli Transetta(DE3)感受态细胞.挑取单克隆，接种于含有氨苄青霉素(50 μg/mL)与氯霉素(34 μg/ml)的5 mL LB液体培养基内，于37 ℃条件下220 rpm摇床上培养约14 h.将上述菌液以1:100(V:V)的比例加入含有氨苄青霉素(50 μg/mL)与氯霉素(34 μg/mL)的液体LB培养基，37 ℃ 220 rpm，活化至OD600 nm为0.6~0.8.加入IPTG，使其终浓度为1 mM，于20 ℃ 220 rpm摇床上继续诱导6 h.
采用GST柱对重组N蛋白进行纯化，取纯化后的重组N蛋白加入3.2 μg PreScission Protease(160 μg/mL纯化介质)，4 ℃反应过夜，即获得纯化的N蛋白.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析.
1.4 IBV N蛋白单克隆抗体的制备取纯化后N蛋白，再向其中加入一定量的弗氏佐剂(初次免疫用弗氏完全佐剂，再次免疫用弗氏不完全佐剂)，将其乳化后皮下多点注射3只6~8周龄的雌性BALB/c小鼠.可在第3次免疫1周后测定小鼠血清中的抗体效价，选取效价高的1只小鼠进行增强免疫，于3 d后细胞融合.
将超强免疫小鼠的脾细胞和SP2/0细胞以1:5~1:10(V:V)的比例混合，离心，弃去上清，轻轻把细胞团打散.用1 mL移液管取37 ℃预热的PEG1500，1 min内缓慢滴加完，保持在37 ℃水浴中缓慢晃动离心管90 s.向其中添加15 mL 37 ℃预热的GNK，放置在37 ℃水浴中温育5 min.补加预热的GNK到40 mL，离心，倒掉上清，将细胞团打散.加入20 mL预热的HAT选择培养基混匀，加到提前一天制备好的饲养细胞内，100 μL/孔，置于37 ℃ 5% CO2培养箱培养.
待杂交瘤细胞状态生长良好时，半量换液后3~4 d进行阳性孔筛选.分别用N蛋白和IBV病毒液作为包被原，SP2/0细胞上清液为阴性对照，采用间接ELISA方法筛选出分泌抗体能力强的阳性孔.选择效价高的阳性杂交瘤细胞按有限稀释法进行亚克隆.重复亚克隆3~4轮.
1.5 IBV N蛋白单克隆抗体的鉴定用体内诱生腹水法对IBV N蛋白mAb进行大量制备.采用辛酸/饱和硫酸铵法对单抗腹水纯化.鉴定其亚型、特异性、与不同IBV毒株的反应、亲和力.
2 结果与分析 2.1 构建pGEX-6p-1-N表达载体用RNAiso Plus从感染IBV H120毒株的尿囊液里提取总RNA，再反转录成cDNA，以cDNA为模板，PCR扩增目的基因.PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，2号泳道明显可见大小约1 230 bp的条带，和预期片段大小相同(图 1).
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图 1 PCR扩增IBV N基因 Figure 1 PCR product of IBV N gene Marker；2：PCR产物 |
如图 2所示，重组表达菌pGEX-6p-1-N-Transetta(DE3)经过IPTG诱导后，在79 kD附近有明显条带，和预期结果一致.经过可溶性分析，超声后的上清中有大量目的蛋白，而沉淀中基本没有，表明20 ℃条件下诱导的重组N蛋白绝大部分是可溶形式表达的.重组N蛋白通过GST柱纯化后，无明显杂带，表明重组N蛋白的纯化效果较好.
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图 2 重组N蛋白的SDS-PAGE鉴定 Figure 2 SDS-PAGE analysis of recombinant N protein 1：Marker；2：诱导前；3：诱导后；4：上清；5：沉淀；6：纯化后；7：NC |
用PreScission Protease酶切融合蛋白并去除GST标签，纯化得到无标签的重组N蛋白，SDS-PAGE鉴定结果显示, 去除标签后的重组N蛋白分子量约为52 kD，与预期大小相符(图 3).Western-blot结果显示，重组蛋白可以与IBV阳性血清反应，说明其具有较好的免疫反应性，具有较好的抗原性(图 4).
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图 3 N蛋白的SDS-PAGE鉴定 Figure 3 SDS-PAGE analysis of the N protein 1：Marker；2：重组N蛋白；3：N蛋白 |
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图 4 N蛋白的Western-bolt鉴定 Figure 4 Western blotting analysis of the N protein 1：Marker；2：重组N蛋白；3：N蛋白 |
经过3轮亚克隆, 获得了13株抗N蛋白单抗(1A3D4、1G1G9、3A8C4、1A3G4、3A5E7、2E4H4、1A12C5、2B3B2、2B3A3、2E2A9、3A5H12、2C4E6、2B5D12)，其中8株能与IBV结合(图 5).
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图 5 抗N蛋白单抗的间接ELISA测定 Figure 5 Indirect ELISA assay of mAb |
选择效价高且能与IBV结合的1A12C5杂交瘤细胞株对其进行大量制备.将纯化前后的1A12C5腹水通过12% SDS-PAGE鉴定分析，纯化后的1A12C5单抗分别在55 kD与25 kD处有明显条带，这两个条带分别为抗体分子的重链与轻链，而且与腹水纯化前相比，纯化后的抗体具有较高的纯度(图 6).
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图 6 1A12C5单抗纯化的SDS-PAGE分析 Figure 6 SDS-PAGE analysis of 1A12C5 mAb purification 1：Marker；2:1A12C5单抗纯化前；3:1A12C5单抗纯化后 |
采用Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Reagents测定纯化后的1A12C5单抗的亚型.亚型鉴定结果中可以看出，在重链的鉴定孔中IgG2b孔的OD450 nm值最高，而在轻链的鉴定孔中kappa孔的OD450 nm值最高(图 7)，由此可以看出1A12C5单抗属于IgG2b重链、κ轻链型.
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图 7 1A12C5单抗亚型鉴定 Figure 7 Identification of 1A12C5 mAb subtype |
用IBV、NDV、IBDV病毒液和阴性尿囊液包被96孔酶标板，间接ELISA鉴定所得1A12C5单抗特异性获得的单抗只对IBV具有特异性，和NDV、IBDV和阴性尿囊液无交叉反应(图 8).
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图 8 1A12C5单抗特异性鉴定 Figure 8 Specific identification of 1A12C5 mAb |
分别用H120、M41、LDT3-A接种的尿囊液进行Western-blot分析.1A12C5单抗能与不同清型的IBV结合(图 9).
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图 9 1A12C5单抗与不同IBV毒株的反应的Western-blot分析 Figure 9 Western-blot analysis of the reaction between 1A12C5 mAb and different IBV strains 1：Marker；2：N蛋白；3：H120；4：M41；5：LDT3-A；6：NC |
根据亲和常数计算公式可以得出1A12C5单抗的亲和常数Ka为1.87×107 L/mol.通常，亲和常数在107~1012 L/mol范围之间表明抗体亲和力较高，1A12C5单克隆抗体具备较高亲和力.
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图 10 1A12C5单抗亲和常数分析 Figure 10 Affinity analysis of 1A12C5 mAb |
根据IBV H120毒株的氨基酸序列可知，N蛋白约为52 kD，pGEX-6p-1本身的融合蛋白GST大小约27 kD，因此重组蛋白分子量为79 kD.在进行SDS-PAGE鉴定时，结果显示表达产物有两种：一种蛋白表达量较高，片段较大，为主要产物；另一种表达量较低，片段较短，是附带产物.在文献[4-6]的报道中出现类似现象，可能是目的蛋白在受电荷影响最大的地方发生断裂所致，可能是融合蛋白的基因编码出错的产物.在IBV、火鸡冠状病毒、小鼠肝炎病毒及副粘病毒中已报道这一类似的现象[7-9].Western-blot分析结果表明两种主要表达蛋白均具有抗原性.
可靠的筛选方法在制备单抗过程中起着关键作用.在细胞融合之前必须建立好合适的筛选方法，避免因为竞争性抑制导致丢失所需的杂交瘤细胞株.本实验利用间接ELISA法，含IBV的尿囊液和纯化后的N蛋白分别作为包被原进行双筛选.在整个实验中，为保证实验条件的一致性，检测使用的抗原包被量和阳性、阴性血清的稀释度均保持一致，同时选择SP2/0细胞上清作为阴性对照，获得了13株能稳定分泌抗IBV N蛋白抗体的杂交瘤细胞株，其中8株能与IBV结合.
N蛋白是IBV的主要结构蛋白之一，在遗传进化中最为保守，不同毒株间同源性最高，病毒感染过程中表达量最大，它与病毒的组装和机体细胞免疫等方面有重要相关性[10].N蛋白可作为抗原进行血清学检测，可以检测各种血清型的抗体，不存在病原检测中范围狭窄的问题.N蛋白可在宿主体内产生高水平的抗体[11]，其诱导机体分泌特异性抗体的时间以及免疫原性都优于IBV的其他蛋白.
Koch研究报道针对IBV N蛋白的单抗具备病毒中和活性.病毒液及组织中有未加工成熟的N蛋白，也可通过特殊处理使病毒内部完全暴露，增强检测效果.研制针对IBV N蛋白的单抗可以与IBV通过抗原抗体发生特异性结合，对于IBV的预防、诊断以及控制有重要的意义.
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