2026, Vol. 58
2. 洛阳职业技术学院 河南 洛阳 471099;
3. 河南省生物工程技术研究中心 河南 郑州 450001
2. Luoyang Polytechnic, Luoyang 471099, China;
3. Henan Bioengineering Technology Research Center, Zhengzhou 450001, China
猴痘的临床症状类似于天花，如高烧、疲累、头疼、皮疹等，易与其他痘科病毒感染混淆，且有数据表明其传播能力很强[1]。因目前没有疫苗和特效药，早诊断、早隔离成为最重要的防控手段。因此，建立灵敏度高、特异性强、操作简单的核酸快速检测方法对预防MPXV的传播至关重要。
国内外已经建立了多种MPXV的诊断方法，包括酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)等[2-4]，这些技术都有其应用场景，但均存在流程烦琐、检测时间较长的缺点。此外，ELISA敏感性低，LAMP易出现假阳性，PCR需要昂贵的设备和有专业要求的人员才能完成[5]。
为了满足现场核酸快速检测的需求，采用RPA-CRISPR/Cas12a联合技术对MPXV进行核酸检测，RPA负责恒温扩增靶标序列以提高序列的拷贝数[6]，CRISPR/Cas12a负责反式切割非靶标序列[7-8]，该联合技术既可以避免RPA的非特异性扩增，又可以提高检测的灵敏度[9]，同时，目的基因进行双重特异性识别，可极大地提高检测特异性[10]。
本研究基于RPA-CRISPR/Cas12a的核酸侧向层析技术，建立一种无须借助仪器设备即可实现对MPXV的快速、便捷、准确且结果可视化的检测方法，并为其他细菌及病毒的诊断、肿瘤标志物检测及病原微生物检测方法的建立提供借鉴和参考。
1 实验部分 1.1 试剂与仪器 1.1.1 试剂选取猴痘病毒(GenBank: AF380138.1，48048~48509)、牛痘病毒(GenBank：MK035759，63463~63931)、天花病毒(GenBank：LR800245，42768~43236)分别与pUC57载体合成阳性质粒(pUC57-AF、pUC57-MK、pUC57-LR)。荧光探针ssDNA，crRNA均由深圳华大基因股份合成序列，RPA引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，T7 High Yield RNA Synthesis Kit购于翌圣生物科技(上海)股份有限公司，RPA核酸扩增试剂盒购自苏州蚂蚁淘生物科技有限公司，质粒小提试剂盒购自天根生物科技有限公司，AsCas12a质粒购自淼灵生物科技有限公司，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside，IPTG)、链霉亲和素、地高辛抗体、鸡IgY抗体、抗鸡IgY抗体、灭活的甲、乙型流感病毒原液、牛血清白蛋白、聚乙二醇20 000、胶体金溶液、玻璃纤维、聚氯乙烯底板(polyvinyl chloride backing plate，PVC板)和硝酸纤维素膜(nitrocellulose membrane，NC膜)由河南省生物工程技术研究中心提供。
1.1.2 仪器Veriti型梯度PCR仪、CFX96型实时荧光定量PCR仪购自ABI公司，MH3030型XYZ三维划膜仪、ZQ20002型切条机购自上海金标生物科技有限公司，101-2A型干燥箱购自北京科伟永兴仪器有限公司，H1850型离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。
1.2 实验过程RPA扩增体系(50 μL)：2×Reaction Buffer 25 μL，dNTPs(2 μmol/L)4.6 μL，水4.6 μL，10×Basic E-mix 5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各2.4 μL，混匀离心；加入2.5 μL 20×Core Reaction Mix，混匀离心；再加入2.5 μL 280 mmol/L MgOAc和1 μL DNA模板，混匀离心后37 ℃反应20 min。
CRISPR-Cas12a荧光检测体系(20 μL)：NEBuffer 3 μL，Cas12a蛋白(4 mmol/L)1 μL，crRNA(60 nmol/L)1 μL，ssDNA探针(10 μmol/ L)0.25 μL，RPA扩增产物1 μL，灭菌水补足至20 μL，混匀离心后在实时荧光定量PCR仪中37 ℃反应58个循环，观察荧光曲线。
胶体金试纸条检测体系(70 μL)：将上述CRISPR-Cas12a检测体系用生理盐水补足至70 μL，混匀后滴至试纸条，15 min内观察检测结果。过程如图 1所示。
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图 1 RPA-CRISPR/Cas12a-LFA原理示意图 Fig. 1 Schematic diagram of the RPA-CRISPR/Cas12a-LFA principle |
从GenBank数据库(AF380 138.1)中筛选MPXV保守序列，设计特异性RPA引物，选取5对高得分引物(RPA1-F/R至RPA5-F/R)进行后续实验。同时，针对引物和目标基因区域设计3条crRNA(crRNA1、crRNA2、crRNA3)，详见表 1。
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表 1 MPXV RPA引物、crRNA序列信息 Tab. 1 Sequence information of RPA primers and crRNA for MPXV |
使用质粒小提试剂盒提取猴痘、牛痘、天花和AsCas12a质粒，使用超微量紫外分光光度计测定质粒含量和纯度。
1.2.3 AsCas12a蛋白制备为表达和纯化AsCas12a蛋白，将AsCas12a质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞[11]，37 ℃培养至600 nm处、光密度(OD600)为0.6~0.8后，加入0.2 mmol/L IPTG诱导表达。通过对诱导温度、时间及IPTG最终浓度进行优化(见表 2)，确定最佳条件后大量诱导目标蛋白。收集菌体后超声破碎并离心，获得蛋白上清液，采用镍柱亲和层析纯化，用梯度咪唑缓冲液洗脱，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)评估纯化效果。最终，运用蛋白质印迹法(western blot，WB)鉴定纯化蛋白，采用His抗体及3, 3′-二氨基联苯胺(3, 3′-diaminobenzidine，DAB)显色，确认目的蛋白的表达和纯化结果。
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表 2 AsCas12a蛋白诱导表达条件优化正交实验设计表 Tab. 2 Orthogonal array design for optimizing induced expression conditions of AsCas12a protein |
使用T7 RNA体外转录试剂盒转录三条设计好的crRNA质粒，经酚/氯仿纯化后，利用超微量紫外分光光度计测定RNA含量和纯度。
1.2.5 RPA引物对筛选及条件优化通过RPA扩增并结合琼脂糖凝胶电泳验证筛选最佳引物对。随后优化RPA反应条件，在不同温度(37、40、42 ℃)下进行20 min反应，以确定最佳温度，再在最佳温度(37 ℃)下设置反应时间分别为5、10、15、20 min，筛选出最优反应时间。
1.2.6 CRISPR/Cas12a条件优化CRISPR-Cas12a荧光检测体系中，探究CRISPR/Cas12a必要组分和筛选最佳crRNA，采用单因素筛选实验优化crRNA、Cas12a、NEBuffer、ssDNA加入量。
1.2.7 核酸试纸条的制备及组装参考实验室免疫层析试纸条制备方法[12]，将胶体金标记的地高辛抗体和鸡IgY铺于胶体金垫(100 μL/4 cm)，37 ℃干燥4 h。将链霉亲和素和抗鸡IgY(1 mg/mL)分别包被于NC膜作为检测线(T线)和质控线(C线)，37 ℃干燥4 h。将胶体金垫、样品垫、吸水垫依次粘贴于NC膜的PVC底板上，并切成4 mm宽试纸条。将70 μL CRISPR/Cas12a反应液混匀后加入检测卡加样孔，反应15 min后读取结果：阳性为T线和C线显色；阴性为C线显色。
1.2.8 胶体金溶液烧制根据实验室现有胶体金制备工艺[13]，加入不同量的氯金酸和柠檬酸三钠制备20、40、60 nm粒径的胶体金溶液。
1.2.9 检测方法材料筛选通过胶体金层析试剂条的制备工艺筛选最佳粒径及抗体标记的最佳pH值。优化抗体标记量、链霉亲和素包被量，分别以试纸条T线显色强弱及重复性为评价指标确定最优条件。同时，采用不同供应商的NC膜、金垫和样品垫筛选最佳组合以提高试纸条显示效果。最后，使用TE缓冲液、0.9% NaCl缓冲液，及去离子水配制样品稀释液，通过核酸层析试纸条检测筛选最佳稀释液。
1.2.10 检测体系反应条件优化在常规实验条件下，以0.9% NaCl缓冲液为稀释液优化试剂条加样量(40~90 μL)，确保完全浸润试剂条以保证反应完全。随后，通过滴加70 μL液体，分别在0、5、10、15、20 min观察质控线(C线)和检测线(T线)的显色情况及背景褪色，优化反应时间与判读时间。
1.2.11 性能评价试验采用pUC57-AF阳性质粒评估方法的灵敏度，并以灭活甲、乙型流感病毒原液及牛痘、天花质粒进行特异性试验，通过重复试验验证结果可靠性。利用最优工艺制备试纸条，在37 ℃下加速稳定性测试，评估不同时间段(0、7、14、21 d)的显色效果判断试纸条稳定性。通过检测高、中、低浓度参考品(104、103、102 copies/μL)，分别分析批内与批间精密度，以显色效果评估反应体系及制备工艺的稳定性和精密度。
1.2.12 方法学比对及模拟临床样本分析采用上述建立的RPA-CRISPR/Cas12a检测方法与PCR方法进行对比。本研究从医院收集40份健康人咽拭子，其中10份加入室内参考品制备成终浓度为102 copies/μL的模拟阳性咽拭子，对正常人咽拭子与模拟阳性咽拭子平行检测，并进一步比较两种方法。
2 结果与讨论 2.1 AsCas12a蛋白的制备IPTG诱导后，AsCas12a蛋白在154 kDa处表达明显(图 2Aa)，WB验证表明其携带His标签，确认为目标蛋白(图 2Ab)。优化实验显示：IPTG浓度对表达量无显著影响，确定最适合浓度为0.1 mmol/L(图 2B)。在16 ℃下，16 h和20 h诱导均获得最高可溶性蛋白，因两者表达量无差异，优选16 h以简化操作(图 2C)。高温(28 ℃和37 ℃)诱导导致蛋白分布于上清和沉淀中，降低可溶性比例及纯化效率。
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图 2 AsCas12a蛋白制备结果 Fig. 2 Analysis of AsCas12a protein preparation results Aa为AsCas12a蛋白小量诱导，1、2、3分别为Marker、诱导前菌体、IPTG诱导后菌体；Ab为AsCas12a蛋白WB鉴定，1、2分别为Marker、诱导后WB鉴定；Ac为AsCas12a蛋白纯化，1、2、3分别为Marker、纯化前电泳图、纯化后电泳图。B为AsCas12a蛋白IPTG加入量SDS-PAGE电泳结果，Ba中，1为Marker，2为诱前，3~7分别为表 2中第1个实验；Bb中，1为Marker，2为诱前，3~7分别为表 2中第2个实验；Bc中，1为Marker，2为诱前，3~7分别为表 2中第3个实验。Ca中，1为Marker，2~9分别为表 2中第4~7个实验组的上清和沉淀；Cb中，1为Marker；2~9分别为表 2中第8~11个实验组的上清和沉淀；Cc中，1为Marker，2~9分别为表 2中的第12~15个实验组的上清和沉淀。 |
镍柱亲和层析纯化后，SDS-PAGE分析显示杂蛋白被有效去除，目标蛋白纯度达90%(图 2Ac)。最终确定AsCas12a蛋白的最适诱导条件为0.1 mmol/L IPTG、16 ℃、16 h。该条件在确保高表达量的同时，最大限度地保留了蛋白的可溶性和活性，为后续应用奠定了基础。
2.2 RPA引物对筛选及条件优化以合成的AF阳性质粒(pUC57-AF)为模板，设计5套引物进行RPA扩增，琼脂糖凝胶电泳结果显示，5套引物均成功扩增出符合目标大小的DNA片段(见图 3A)。其中，P4引物对扩增的产物量最多，因此选取P4引物用于后续实验。
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图 3 RPA引物对筛选及条件优化 Fig. 3 Primer screening and reaction optimization for RPA A为RPA引物筛选结果图，1为Marker，2~6分别为RPA1、2、3、4、5产物；B为RPA反应温度结果图，1为Marker，2~4分别为42、40、37 ℃时的结果; 图C为RPA反应时间结果图，1为Marker，2~5分别为5、10、15、20 min时的结果。 |
应用核酸电泳检测RPA扩增MPXV基因，结果表明，RPA在37~42 ℃范围内均可高效扩增，为兼容多种检测条件，确定37 ℃为最佳反应温度(见图 3B)。在此条件下，不同反应时间的扩增效果表明，延长反应时间可增强核酸条带亮度，但非特异性扩增概率随之增加(图 3C)。综合考虑检测准确性、稳定性和快速性，将最佳反应时间定为15 min。
优化后的RPA反应条件(37 ℃、15 min)显著提高了扩增效率，为后续快速检测提供了可靠保障。
2.3 CRISPR/Cas12a条件优化以最短时间获得最强荧光信号为准则，系统优化CRISPR-Cas12a检测体系的关键组分及其用量。结果表明，crRNA、Cas12a、NEBuffer缓冲液及ssDNA均为反应必需成分，其中，crRNA1为最优crRNA。当crRNA加入量为0.25 μL，Cas12a加入量为1 μL，NEBuffer缓冲液加入量为3 μL时，荧光强度达到最大值。ssDNA加入量为1.5 μL时，尽管荧光强度最高，但反应达到平台期的时间较长，综合考虑，选定0.25 μL作为后续试验用量(如图 4)。优化后的体系在确保高荧光强度的同时，缩短了反应时间，为高效快速的CRISPR-Cas12a检测提供了可靠依据。
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图 4 CRISPR/Cas12a条件优化结果 Fig. 4 Optimization results of CRISPR/Cas12a reaction conditions A为CRISPR/Cas12a关键组分探索图; B为最优crRNA选择图; C为Cas12a蛋白最佳加入量探索图; D为最佳crRNA添加探索图; E为NEBuffer最优缓冲液添加探索图; F为最优ssDNA添加探索图。 |
利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，用Zetasizer Ultra分析粒径，经实验可知还原剂增加使平均粒径减小。紫外-可见分光光度计检测吸收光谱(400~600 nm)并记录最大吸收峰，随着还原剂用量的增加，金颗粒平均粒径减小，最大吸收峰波长也减小(见图 5A)。以上制备的胶体金，颗粒较为均匀，质量良好。随着胶体金粒径增大，检测线条条带颜色更深，层析效果更好且背景更清晰。56.07 nm的金颗粒可提供最佳可视性与清晰度，因此选为实验用粒径(图 5B)。利用K2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值，当加入量为10 μL时，胶体金试纸条显色效果最好，确定为最佳添加量(图 5C)。在最佳pH值下，抗体加入量为5 μg时，胶体金试纸条显色效果最好，选择最低加入量5 μg作为标记量(图 5D)。
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图 5 胶体金免疫层析检测方法材料筛选结果 Fig. 5 Screening results of materials for colloidal gold immunochromatographic assay Aa、Ab、Ac分别为22.10、46.33、56.07 nm胶体金溶液紫外-可见光分光光度计检测结果; Ba、Bb、Bc分别为22.10、46.33、56.07 nm胶体金层析试纸条结果; Ca、Cb、Cc分别为K2CO3溶液加入5、10、15 μL胶体金层析试纸条结果; Da、Db、Dc分别为标记抗体加入量为5、10、15 μg胶体金层析试纸条结果; Ea、Eb、Ec分别为包被量为0.5、1、1.5 mg/mL胶体金层析试纸条结果; Fa、Fb、Fc分别为G140、JJ140、CN140 NC膜; Ga、Gb、Gc分别为Sap-Z90、GL-Ⅱ、PF-P78金垫; Ha、Hb、Hc分别为Sap-Z90、GL-Ⅱ、PF-P78样品垫; Ia、Ib、Ic分别为TE缓冲液、ddH2O、0.9%NaCl缓冲液。 |
为提高试纸条的检测灵敏度，优化链霉亲和素包被量，实验结果显示1 mg/mL和1.5 mg/mL效果相当，选取1 mg/mL作为最适包被量(图 5E)。通过筛选三种NC膜，发现G140显色效果最佳且背景清晰，选其作为NC膜载体(图 5F)。金垫材料对层析效果至关重要，筛选结果表明Sap-Z90玻璃纤维具备优良的标记物复溶与释放特性，检测线显色效果最佳(图 5G)。同时，Sap-Z90玻璃纤维作为样品垫能均匀分布样品并控制液体流速，表现优异(图 5H)。稀释液方面，TE缓冲液与0.9%NaCl缓冲液显色效果均良好，因0.9%NaCl更接近人体环境，最终选其作为样本缓冲液(图 5I)。
上述优化过程显著提升了试纸条检测的灵敏度、稳定性和实用性，为快速、可靠的核酸检测奠定了坚实基础。
2.5 检测体系反应条件优化液体加样量实验显示，0.9%NaCl缓冲液在40 μL即可完全浸润试剂条，但为保证缓冲液充足，选择70 μL作为反应体积(见表 3)。
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表 3 不同液体加样量实验结果 Tab. 3 Experimental results of liquid sample volume optimization |
反应时间和判读时间实验表明：0 min时未显色，5 min时C线、T线出现，试剂条背景开始变白；10 min时条带清晰、显色增强且背景清晰；15 min及20 min时显色稳定且不再变化。综合考虑显色效果与实验效率，确定反应时间为0~15 min，判读时间为15~20 min(见表 4)。
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表 4 反应时间与判读时间的确定实验 Tab. 4 Experimental results for determining optimal reaction and reading times |
优化结果表明，70 μL反应体积与适宜的反应时间和判读时间平衡灵敏度与操作简便性，为后续检测提供了稳定性和可靠性支持。
2.6 性能评价利用RPA引物扩增AF阳性质粒(pUC57-AF)DNA，并稀释至不同浓度(104、103、102、101、100、10-1 copies/μL)进行CRISPR/Cas12a-LFA检测，结果显示，该检测体系的下限为10 copies/μL，具有较高的灵敏度(见图 6Aa)。针对猴痘、牛痘、天花质粒及灭活的甲、乙型流感病毒原液进行检测，结果表明，只有猴痘质粒的试纸条为阳性，其余均为阴性，表明该体系具有较好的特异性(见图 6Ab)。
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图 6 性能评价 Fig. 6 Performance evaluation Aa中1~7分别为阴性、104 copies/μL、103 copies/μL、102 copies/μL、101 copies/μL、100 copies/μL、10-1 copies/μL灵敏度实验结果；Ab中1~6分别为阴性对照、阳性对照、H1N1、BV、牛痘质粒、天花质粒特异性实验结果; B中Ba~Bd分别为加速0、7、14、21 d稳定性实验结果; C中Ca~Cc分别为第1、2、3批精密性实验结果。 |
通过高温加速破坏实验评估试纸条的稳定性，在37 ℃下分别加速破坏0、7、14、21 d，结果显示，试纸条的显色效果无明显变化，表明其稳定性较好(见图 6B)。此外，精密性检测表明批内和批间的加样检测结果一致性良好，符合实验要求(见图 6C)。
综上所述，所建立的RPA-CRISPR/Cas12a-LFA检测体系具有高灵敏度、优异的特异性、良好的稳定性以及较好的精密性，适用于猴痘等病毒的快速检测。
2.7 方法学比对及模拟临床样本分析使用RPA-CRISPR/Cas12a与PCR方法对30份正常人咽拭子和10份模拟阳性咽拭子进行检测。结果显示，RPA-CRISPR/Cas12a检出9份阳性，31份阴性；PCR方法则检出10份阳性，30份阴性，两者结果几乎一致，表明RPA-CRISPR/Cas12a检测方法与PCR方法具有相似的灵敏度和特异性(见表 5)。
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表 5 RPA-CRISPR/Cas12a方法与PCR方法检测模拟样品的结果比较 Tab. 5 Comparison of detection results between RPA-CRISPR/Cas12a and PCR methods for simulated samples |
该对比实验验证了RPA-CRISPR/Cas12a方法在检测中的可行性和准确性，具有较高的潜力，可用于快速、灵敏的现场检测。
3 结语猴痘病毒基于它的传播特点，其检测方法的优劣性对防控效果影响巨大。为此，张睿等[14]建立了猴痘病毒PCR检测方法，但该检测方法在扩增过程中需要使用变温程序，检测时间为2 h，且不能实现可视化快速检测。许晓琳等[15]利用LAMP反应体系中内引物、环引物体积及反应温度建立了一种MPXV实时荧光LAMP检测方法，此方法需要设计多条引物对，增加了前期引物设计的难度和成本。2024年已有研究利用MPXV F3L基因为靶序列建立MPXV RT-PCR检测方法[16]，此方法在检测过程中需要使用专业的仪器设备，不能便捷地应用到现场检测应用。本研究建立的RPA-CRISPR/Cas12a-LFA的MPXV检测方法利用RPA技术实现快速扩增，CRISPR/Cas12a体系进行靶标验证，在试纸条上呈现检测结果，成功建立了一种全新的RPA-CRISPR检测信号放大器，可在1 h内实现MPXV核酸可视化快速检测。
RPA-CRISPR-LFA技术具备高灵敏度和特异性，能够在等温条件下快速扩增并识别目标核酸序列，实现快速、精准检测。同时，该技术操作简便，无须复杂设备，仅需恒温条件，适合现场使用，并通过LFA试纸条直接肉眼观察检测结果，特别适用于资源有限的环境或基层检测场景。此外，RPA-CRISPR-LFA具有快速出结果的优势，便于快速诊断，加之LFA试纸条便于携带，更适合进行现场快速检测。但操作不当或污染等因素可能导致假阳性或假阴性结果。在之后的实验中，将通过引入高特异性CRISPR酶、优化RPA试剂设计、增强信号检测敏感性并严格控制反应条件，有效降低RPA-CRISPR-LFA检测中的假阳性和假阴性风险。
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