八仙花 (Hydrangea macrophylla) 又名大花绣球、阴性绣球等，属虎耳草科八仙花属，原产于中国和日本，在我国广泛用作观赏灌木和盆栽花卉。八仙花品种繁多，主要的花色有红色、粉色、白色、蓝色等^[1]。研究发现，八仙花颜色会由于栽培方式、周围环境变化而变化，如八仙花花色与土壤 pH 值有关，在中性或碱性土壤中呈现粉红色，在酸性土中呈蓝色^[2–3]。Ito 等^[4]发现蓝色品种八仙花花瓣内 Al³⁺ 含量比红色品种高 39 倍。Schreiber 等 ^[5]分析了多个红色、紫色和蓝色八仙花品种色素及 Al³⁺ 含量，发现红色品种花瓣 Al³⁺ 含量范围为 0～10 μg/g FW，紫色品种含量范围为 10～40 μg/g FW，蓝色品种 Al³⁺ 含量大于 40 μg/g FW，并提出八仙花呈现不同颜色是因为不同浓度的 Al³⁺ 与飞燕草素-3-葡萄糖苷形成的复合物呈色反应不同造成的。在酸性条件下，苹果酸等会激活 Al³⁺ 运输通道，从而促进根系 Al³⁺ 的吸收^[6]。在八仙花花瓣内，Al³⁺ 的积累主要是通过两个铝离子转运蛋白来实现，分别位于质膜和液泡膜上 [其编码基因分别为质膜铝转运基因 plasma membrane Al transporter (PALT) 和液泡膜铝转运基因 vacuolar Al transporter (VALT)]，均属于水通道蛋白家族。质膜铝离子转运蛋白将 Al³⁺ 从细胞外运输到细胞质中，继而由液泡膜铝转运蛋白运输到液泡并储存起来^[7]，与液泡中的飞燕草素-3-葡萄糖苷形成复合物。

我国八仙花品种繁多，当前研究主要关注八仙花组织培养、耐铝毒害机制等^[8–9]。本研究以浙江省主要的八仙花品种之一‘蓝色妈妈’为材料，分析了不同浓度 Al₂(SO₄)₃ 处理对其花色、花青苷含量、Al³⁺ 含量及 Al³⁺ 跨膜运输相关基因表达的影响，探讨通过控制根域 Al³⁺ 浓度调控八仙花花色，满足市场需求。

采用八仙花品种为‘蓝色妈妈’，种苗购自浙江虹越花卉有限公司。2015 年 4 月，在扦插苗中选取整齐一致的幼苗移入标准 1 加仑营养盆中进行处理，栽培基质为混合基质 (珍珠岩∶蛭石∶草炭之比为 1∶1∶1，pH 6)。试验设置 3 个处理：1) CK，根系添加 pH 为 6 的柠檬酸缓冲液；2) 根系添加 2‰ Al₂(SO₄)₃，用柠檬酸缓冲液将 pH 调节至 6；3) 根系添加 4‰ Al₂(SO₄)₃，用柠檬酸缓冲液将 pH 调节至 6。在植株出现花蕾约 1 cm 时开始进行处理，以后每周处理 1 次，直至现蕾，每处理 4 次重复。开花盛期时拍照进行花色分析，取花瓣鲜样进行色素含量分析，取样品液氮冷冻放入 –80℃ 冰箱供基因表达水平分析。

提取方法参照考 Park 等^[10]的方法并略作修改。取 5 g 鲜样，加入 10 mL 5% 甲酸溶液，研磨至匀浆，超声 30 min，4000 rpm/min 离心，上清液过 0.45 μm 滤膜，得到提取液。将提取液进高效液相色谱 (LC-20AT，日本岛津公司) 进行分析。色谱柱为 InertSustain C18 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，流动相 A 相为 5% 甲酸水溶液，B 相为 5% 甲酸乙腈，进样量 20 μL，流速 1.0 mL/min。线性洗脱梯度：0 min，5% B；8～13 min，13%B；13～20 min，17% B；20～23 min，17% B；23～30 min，20%B；30～40 min，20% B；40～40.1 min，5% B；40.1～50 min，5%B。检测波长 520 nm。样品定量采用外标法，标准品为矢车菊-3,5-双葡萄糖苷 ^[11]，标准曲线为 y = 15188.01x – 16778.39 (R² = 0.999)。质谱分析采用高效液相色谱离子质谱联用仪 (6460 Triple Quad LC/MS，美国安捷伦科技有限公司)。质谱条件参照宋亚等^[12]的方法，采用综合色谱相对保留时间、质谱分子离子峰和碎片离子峰等确定其分子结构。

称取花瓣样品 10 g，将其放入到烘箱中烘干至恒重，样品经磨碎、过 0.425 mm 筛，用 V(H₂SO₄)∶V(H₂O₂) = 3∶1 消煮样品，利用 ICP-AES (inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy) 测定离子含量。

RNA 提取采用基于 Trizol 法的 RNA 试剂盒 (Simgen) 进行，按说明书操作提取 RNA。反转录生成 cDNA，在荧光定量 PCR 反应体系混合液中加入 2 μL 稀释后的 cDNA 模板，充分混匀。然后放置于 ABI PRISM^®7000 荧光 PCR 仪中进行荧光定量 PCR。PCR 程序为 95℃ 变性 1 min；聚合反应阶段 95℃ 5 s，60℃ 33 s，40 次循环；95℃ 15 s，60℃ 20 s，95℃ 15 s。各基因和内参基因 PCR 引物采用 Negishi 等^[7]设计的引物，18S rRNA 为内参基因，各基因引物如下：VALT，5′-GGCCCTAGCAGAGTTCTTCTCT-3′，5′-AATGTAATGTTCCCACCAAGGA-3′；PALT1，5′-ACCTGTAACTCCAGGGACTCCT-3′，5′-TATGAACTCAGCTCCCACCTTT-3′；18S rRNA，5′-GGAAGTTTGAGGCAATAACAGG-3′，5′-ATTGCAATGATCTATCCCCATC-3′。

由图 1 可知，在对照 (CK) 植株中，‘蓝色妈妈’颜色为粉红色略带白色，是该品种的典型颜色，2‰ Al₂(SO₄)₃ 处理后，花瓣颜色呈现淡紫色，4‰ Al₂(SO₄)₃ 处理 21 d 后，花瓣颜色转为蓝紫色。试验表明，Al₂(SO₄)₃ 处理后能明显改变‘蓝色妈妈’花瓣颜色。

图1(Fig. 1)

图1 Al2(SO4)3 处理对‘蓝色妈妈’花色的影响 Fig. 1 Effects of the Al2(SO4)3 application on flower colour in ‘mama blue’

经质谱分析，‘蓝色妈妈’花瓣中检测到了 12 种花青苷 (图 2)，其中 11 种为芍药花素-3-葡萄糖苷、芍药花素-3,5-双葡萄糖苷、飞燕草素-3-戊糖-5葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷、飞燕草素-3-戊糖苷、矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷、矢车菊素-3-戊糖苷、矢车菊素-3-芥子酰-阿魏酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷、矢车菊素-3-p-香豆酰-芥子酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷、矢车菊素-3-咖啡酰-丙二酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷和矢车菊素-3-p-香豆酰-p-香豆酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷，另一种成分未知 (表 1)。

表1(Table 1)

表1 八仙花花青苷主要成分及含量 Table 1 The main composition and contents of anthocyanins of Hydrangea macrophylla

表1 八仙花花青苷主要成分及含量 Table 1 The main composition and contents of anthocyanins of Hydrangea macrophylla 出峰顺序 Peak sequence 保留时间 (min) Retaining time 质谱离子/[H+] Molecular 推测花青苷成分 Predicted components of anthocyanin 含量 Content (μg/g, FW) CK 2‰ Al2(SO4)3 4‰ Al2(SO4)3 1 9.414 301、463 芍药-3-葡萄糖苷 C22H23O11 25.9 b 86.6 a 98.6 a 2 9.767 301、625 芍药-3,5-双葡萄糖苷 C28H33O16 63.7 b 289.3 a 299.7 a 3 10.138 303、465、597 飞燕草-3-戊糖-5-葡萄糖苷 C26H29O16 142.3 c 805.6 b 1114.9 a 4 10.531 303、465 飞燕草-3-葡萄糖苷 C21H21O12 4679.2 c 23610.0 b 29129.7 a 5 11.140 303、435 飞燕草-3-戊糖苷 C20H19O11 158.5 a 68.0 b 8.9 c 6 12.056 287、449、611 矢车菊-3,5-双葡萄糖苷 C27H31O16 694.3 a 507.8 b 339.4 c 7 12.274 287、419 矢车菊-3-戊糖苷 C20H19O10 105.5 c 123.2 b 148.2 a 8 12.558 303、435 飞燕草-3-戊糖苷 C20H19O11 74.4 a 74.4 a 84.0 a 9 13.316 303、343、419、619 未知 28.4 c 37.6 b 91.5 a 10 13.741 287、535、993、1241 矢车菊-3-芥子酰-阿魏酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷 C57H61O31 13.0 b 14.8 b 187.2 a 11 14.501 287、535、963、1211 矢车菊-3-p-香豆酰-芥子酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷 C56H59O30 27.2 c 91.3 a 44.5 b 12 19.307 287、535、773、1021 矢车菊-3-咖啡酰-丙二酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷 C45H49O27 62.9 c 794.5 b 1015.2 a 13 20.587 287、449、903、1065 矢车菊-3-p-香豆酰-p-香豆酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷 C51H53O25 24.0 b 44.1 a 49.5 a 注（Note）：同行数据后不同字母表示差异显著 (P < 0.05) Values followed by different letters in the same row indicate significant differences at the 0.05 level.

图2(Fig. 2)

图2 ‘蓝色妈妈’花瓣花青苷组分色谱图 Fig. 2 The anthocyanins components chromatogram of ‘mama blue’ petal

从生色团 (chromophores) 类别上来说，飞燕草素苷中，随着 Al₂(SO₄)₃ 处理浓度的增加，飞燕草素-3-戊糖-5葡萄糖苷、飞燕草素-3-葡萄糖苷含量显著 (P < 0.05) 提高；其中，飞燕草素-3-戊糖-5葡萄糖苷含量从 142.3 μg/g FW 增加到 805.6 μg/g FW 和 1114.9 μg/g FW，而飞燕草素-3-葡萄糖苷含量从对照的 4679.2 μg/g FW 增加到 23610.0 μg/g FW 和 29129.7 μg/g FW。此外，保留时间为 11.14 min 的飞燕草素-3-戊糖苷含量相比对照显著 ( P < 0.05) 降低，而保留时间为 12.558 min 的飞燕草素-3-戊糖苷则不受 Al ₂(SO₄)₃ 处理的影响。对于矢车菊素苷，矢车菊素-3-戊糖苷和矢车菊素-3-咖啡酰-丙二酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷的含量相比对照显著提高，尤其是矢车菊素-3-咖啡酰-丙二酰-槐糖苷-5-葡萄糖苷，含量从 62.9 μg/g FW 增加到 794.5 μg/g FW 和 1015.2 μg/g FW；矢车菊素-3-p-香豆酰-芥子酰-槐糖苷-5-丙二酰-葡萄糖苷含量在 2‰ Al₂(SO₄)₃ 处理后显著增加，而在 4‰ Al₂(SO₄)₃ 处理中相比前者略微降低，但仍显著高于对照；同时，矢车菊素-3,5-双葡萄糖苷含量在 Al₂(SO₄)₃ 处理后降低，且下降幅度和 Al₂(SO₄)₃ 浓度呈正相关。芍药花素苷中，芍药花素-3-葡萄糖苷、芍药花素-3,5-双葡萄糖苷含量均在 2‰ Al₂(SO₄)₃ 处理后大幅增加，然而提高 Al₂(SO₄)₃ 处理浓度对于增幅影响不明显。从花青苷总体含量而言，矢车菊素苷、飞燕草素苷和芍药花素苷含量均随着 Al₂(SO₄)₃ 处理浓度增加而显著增加。2‰ Al₂(SO₄)₃ 和 4‰ Al₂(SO₄)₃ 处理处理后，矢车菊素苷含量从 CK 的 926.8 μg/g FW 增加到 1575.7 μg/g FW 和 1784.0 μg/g FW；飞燕草素苷含量从 CK 的 5159.9 μg/g FW 增加到 24681.2 μg/g FW 和 30485.7 μg/g FW；芍药花素苷含量从对照的 99.7 μg/g FW 增加到 375.9 μg/g FW 和 399.2 μg/g FW。

从表 2 可知，2‰ Al₂(SO₄)₃ 处理显著 (P < 0.05) 提高了花瓣 Al ³⁺ 含量，4‰ Al₂(SO₄)₃ 处理后 Al³⁺ 含量进一步提高，且显著 (P < 0.05) 高于 2‰ Al ₂(SO₄)₃ 处理，分别从对照的 2.24 μg/g FW 增加到 5.12 μg/g FW 和 11.83 μg/g FW。与对照相比，2‰ 和 4‰ 的 Al₂(SO₄)₃ 处理均显著 (P < 0.05) 提高了 Mn ²⁺ 和 Mg²⁺ 含量，但两浓度处理之间无显著差异。Al₂(SO₄)₃ 处理对 Fe³⁺ 含量无显著影响。

表2(Table 2)

表2 硫酸铝处理对几种金属离子含量的影响 (μg/g，FW) Table 2 Effects of the Al2(SO4)3 application on several metal ions contents

表2 硫酸铝处理对几种金属离子含量的影响 (μg/g，FW) Table 2 Effects of the Al2(SO4)3 application on several metal ions contents 处理 Treatment Al3+ Fe3+ Mn2+ Mg2+ Zn2+ CK 2.24 ± 0.09 c 3.45 ± 0.11 a 0.87 ± 0.03 b 51.13 ± 1.68 b 0.88 ± 0.01 a 2‰ Al2(SO4)3 5.12 ± 0.64 b 3.37 ± 0.36 a 1.27 ± 0.17 a 69.65 ± 6.30 a 0.59 ± 0.06 b 4‰ Al2(SO4)3 11.83 ± 0.84 a 3.68 ± 0.21 a 1.06 ± 0.10 a 61.70 ± 2.78 a 0.50 ± 0.02 b 注（Note）：同列数据后不同字母表示差异显著 (P < 0.05) Values followed by different letters in the same column indicate significant differences at the 0.05 level.

图 3 表明，2‰ Al₂(SO₄)₃ 处理显著 (P < 0.05) 提高了花瓣 PALT 基因和 VALT 基因的表达水平，4‰ Al₂(SO₄)₃ 处理进一步提高了两基因的表达水平，且均显著 (P < 0.05) 高于 2‰ Al ₂(SO₄)₃。

图3(Fig. 3)

图3 Al2(SO4)3 处理对 PALT 和 VALT 表达的影响 Fig. 3 Effects of the Al2(SO4)3 application on expression of PALT and VALT

八仙花品种多样，颜色丰富，观赏性强，其颜色受外界环境条件等因素影响。本研究发现，通过在根系施用不同浓度的 Al₂(SO₄)₃，‘蓝色妈妈’八仙花花色能从粉红色转变为淡紫色和蓝紫色。这与 Neumann 等^[13]的研究结果相一致，Neumann 还发现施用 Al₂(SO₄)₃ 改变八仙花颜色存在品种特异性，部分品种花色不会受到 Al₂(SO₄)₃ 影响。

花青苷是主要的呈色物质之一。八仙花主要的呈色物质均由飞燕草素-3-葡萄糖苷衍生物单体衍生而来，不同颜色花瓣中，所含有的花青素生色团不同，蓝色花瓣中以飞燕草素-3-葡萄糖苷衍生物为主，在粉色花瓣中包含了天竺葵素生色团或矢车菊素生色团^[14]。本研究分析了八仙花所含花青苷种类和含量，‘蓝色妈妈’花瓣中含有 12 种花青苷 (表 1)。在粉色花瓣中含有一定量的矢车菊素苷，含量最高的是飞燕草素-3-葡萄糖苷，这与贾洪菊^[15]的研究结果相类似。施用 Al₂(SO₄)₃ 后，伴随着颜色从粉色转为紫色和蓝紫色，飞燕草素苷 (尤其是飞燕草素-3-戊糖-5葡萄糖苷和飞燕草素-3-葡萄糖苷花青苷) 的含量大幅度提高。Al₂(SO₄)₃ 处理后，矢车菊素苷含量出现明显上升，说明其也受 Al³⁺ 诱导。这说明花青苷组成和含量变化是外源 Al₂(SO₄)₃ 改变八仙花颜色的原因之一。

在八仙花中，Al³⁺ 能与飞燕草素-3-葡萄糖苷形成复合物，介导花色变蓝^[16]。在不同颜色的花瓣中，Al³⁺ 含量与花瓣颜色密切相关。本研究发现，伴随着施用 Al₂(SO₄)₃ 浓度的提高，花瓣中 Al³⁺ 含量显著提高，施用 4‰ Al₂(SO₄)₃ 的后，花瓣中 Al³⁺ 含量达到 11.83 μg/g FW。与 Schreiber 等^[5]提出的蓝色花瓣 Al³⁺ 含量范围相比，本研究中含量数值略低，一方面可能是由于花的颜色并未呈现典型的蓝色，而是介于蓝色和紫色之间，另一方面也可能是由于根域 pH 值高于 Al³⁺ 吸收的最适 pH 范围 (4.2～4.7)^[13]，影响了 Al³⁺ 的吸收。

在八仙花花瓣中，Al³⁺ 的积累主要依赖于水通道蛋白转运基因 PALT 和 VALT。其中 PALT 编码的水通道蛋白将 Al³⁺ 从质膜外运输到细胞质中，接着由 VALT 编码的水通道蛋白将 Al³⁺ 输送至液泡中贮存起来^{[7, 17]}。本研究发现，Al₂(SO₄)₃ 处理后，PALT 和 VALT 基因的表达均显著上调，说明转运 Al³⁺ 进入花瓣液泡的能力显著增强，有利于 Al³⁺ 的积累。这与本研究观测到的 Al₂(SO₄)₃ 处理后花瓣中 Al³⁺ 含量显著增加的结果相符合。

综合上述分析，一定浓度的 Al₂(SO₄)₃ 处理，诱导了八仙花 PALT 和 VALT 的表达，提高了花瓣 Al³⁺ 的积累，增加了花瓣中飞燕草素-3-葡萄糖苷类含量，从而有利于形成飞燕草素-3-葡萄糖苷和 Al³⁺ 复合体，促进了八仙花从粉红色转变为蓝色。本研究为进一步揭示观赏植物的花色分子调控机制提供了理论基础，为培育满足市场需求的新型花卉奠定了基础。