0 引言

肿瘤免疫治疗近年来迅速发展，除了工程化T细胞疗法如CAR-T、TCR-T以及CAR-NK细胞疗法、免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitors, ICIs）之外，肿瘤治疗性疫苗技术也日益受到关注。

当肽分解产物作为新表位表达于主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex, MHC）表面并被CD4⁺/CD8⁺T细胞识别时，基因突变产物可作为肿瘤新抗原，新抗原被认为是基于T细胞免疫疗法的安全有效靶点^[1]。然而个体化新抗原疫苗具有高度异质性，需要经过个体化抗原检测、抗原肽定制合成等繁琐的步骤，应用面临着时间及经济成本等问题^[2]。基于个体化新抗原疫苗临床应用所面临的困境，原位疫苗越来越受到大家的关注。

所谓“原位疫苗”即在肿瘤局部特异性地诱导和刺激抗肿瘤免疫反应，利用肿瘤“自身”作为“抗原库”，通过释放肿瘤抗原、激活抗原递呈细胞的成熟及活化等多种途径增强肿瘤免疫原性，实现肿瘤“冷-热”转化，最终激活局部及全身抗肿瘤免疫的一种免疫疗法^[3-4]。原位疫苗的应用最早可以追溯到19世纪后期，外科医生William Coley给多种恶性肿瘤患者瘤内注射由灭活的化脓性链球菌和粘质沙雷氏菌组成的混合物，观察到了肿瘤消退现象，这种混合物被称为Coley毒素^[5]。20世纪90年代以来，对浅表性膀胱癌患者膀胱内灌注卡介苗（bacillus Calmette-Guérin, BCG）成为了非肌肉浸润性膀胱癌的标准疗法^[6]。但总体而言，原位疫苗的发展与其他抗肿瘤手段相比较为缓慢。近年来，随着肿瘤免疫治疗在基础研究和临床应用层面的迅速发展，原位疫苗技术逐渐受到关注。目前实现原位疫苗的策略主要包括两大类，即瘤内免疫注射和放射治疗。二者实现原位疫苗接种的方式、作用机制各不相同：放疗诱导免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death, ICD）这一原位疫苗的始动步骤，而瘤内免疫注射主要作用于抗肿瘤免疫循环的后续步骤，如促进抗原递呈及T细胞活化等等。联合二者作用于复杂的免疫网络，往往比单一疗法能获得更佳的疗效。其联合应用发挥作用的机制复杂，目前尚处于探索阶段，总体来说，联合二者可通过增强多种肿瘤特异性抗原（tumor-specific antigen, TSA）或肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen, TAA）^[7-8]的表达和递呈，提高死亡肿瘤细胞释放的损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）水平、细胞溶质DNA积累和感知来协同增强肿瘤微环境（tumor microenviroment, TME）的抗原性及佐剂性^[9]，从而有效实现肿瘤的“冷-热”转化^[10]，激活机体的抗肿瘤免疫，达到“1+1 > 2”的效果。

1 放疗和瘤内免疫注射作为原位疫苗的机制 1.1 放疗作为原位疫苗的作用机制

放射治疗是利用放射线治疗肿瘤的一种局部治疗方式，但是随着放疗相关远隔效应的发现，由局部放疗启动的全身抗肿瘤免疫效应越来越引起大家的重视。放疗通过改变肿瘤局部的免疫抑制性TME以及增强肿瘤抗原性和佐剂性来增强抗肿瘤免疫。相关的机制研究目前还不够深入，已知的有以下几点：

1.1.1 放疗引发免疫细胞对肿瘤细胞的识别

放疗直接损伤DNA并引起ICD、释放大量TAA或TSA供免疫细胞识别，所释放抗原类型则可能与瘤种相关。ICD作为一种伴随着大量TAA和DAMPs释放的死亡模式，是实现原位疫苗接种的始动步骤，为原位疫苗的建立提供抗原和佐剂。

放疗所诱导的ICD伴随着多种DAMPs如三磷酸腺苷、钙网蛋白、高迁移率族蛋白B1（high mobility group box 1, HMGB1）、热休克蛋白（heat shock proteins, HSPs）、ERP57的释放，这些DAMPs与树突状细胞（dendritic cells, DCs）上的模式识别受体（pattern recognition receptors, PRRs）相结合以促进DCs的成熟和活化，以确保有效的抗原递呈及T细胞的启动^[11]。除了释放大量TAA，研究表明放疗引起的肿瘤组织基质的破坏也可增强免疫识别^[12]。

1.1.2 放疗激活先天性及适应性免疫

放疗通过激活cGAS/STING通路来增加Ⅰ型干扰素（Interferon, IFN）的表达。研究表明抗肿瘤T细胞反应由CD8α⁺CD103⁺肿瘤浸润性DCs亚群所介导，而DCs可通过此通路感知肿瘤细胞来源的DNA，故放疗可通过促进DCs的激活及抗原的有效递呈^{[11, 13-14]}来促进抗肿瘤免疫效应的产生。此外，放疗也增加Fas表达^[15]、抑制PD-1/PD-L1通路^[16]。

1.1.3 放疗调节TME

放疗促进CXCL9、CXCL10、CXCL16等多种趋化因子^[11]的表达上调，可募集效应性CD8⁺T细胞和辅助性CD4⁺T细胞向肿瘤部位的迁移。此外，放疗也可促进多种细胞因子^[16-18]（如IL-1β、IL-1α、TNF-α、IL-6、IL-10以及Ⅰ、Ⅱ型IFN）表达的上调，最终在一定程度上逆转免疫抑制性TME^[19]。

1.1.4 放疗诱发远隔效应

值得注意的是，放疗后有时可以观察到“远隔效应”，即放疗之后出现非照射部位的肿瘤消退现象。然而其发生率很低，这也恰恰证明了单纯进行放疗很少能够诱导较为强烈的抗肿瘤免疫，需要与其他疗法联合来达到更佳的疗效。如何把握能最大化实现原位疫苗效应的放疗的剂量、方式、与其他疗法联合时的先后顺序等值得深入探索。2020年Jarosz-Biej等^[20]通过对黑色素瘤小鼠进行不同剂量（2、5、10、15 Gy）的近距离放疗发现：10 Gy剂量对肿瘤血管密度、肿瘤浸润巨噬细胞水平、肿瘤浸润细胞毒性CD8⁺T淋巴细胞水平的影响最大，可显著抑制肿瘤生长。此外，在多项临床前和临床研究中，8~12 Gy剂量的放疗已被证明能够激活原位疫苗效应^[21-23]。在技术方面，相对于传统放疗技术，立体定向放疗（stereotactic body radiotherapy, SBRT）在同等剂量下能杀伤更多的肿瘤细胞且对周围组织的损伤更小，往往更能诱发原位疫苗效应^[24]。

1.2 瘤内免疫注射作为原位疫苗的作用机制

瘤内免疫注射是指通过向肿瘤局部注射免疫药物如免疫细胞、溶瘤制剂、细胞因子、免疫调节性单克隆抗体、细菌和毒素、Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）激动剂^[4]等，来促进大量抗原的释放，从而形成“抗原工厂”，增强抗原递呈细胞的递呈能力、提高T淋巴细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，以达到激活机体免疫系统、增强机体抗肿瘤免疫的目的。常用于瘤内注射的免疫细胞有DCs、自然杀伤细胞（natural killer cells, NK）、T细胞等，通过增强抗原递呈、识别并靶向肿瘤细胞表面蛋白等机制来增强机体的抗肿瘤免疫。溶瘤制剂包括溶瘤病毒和溶瘤分子，主要通过直接靶向、裂解肿瘤细胞，激活固有免疫，诱导适应性免疫来发挥抗肿瘤作用，也可被编辑以表达转基因来刺激免疫反应^[25]。细胞因子常见的有IL-2、IFN-α、IFN-γ、IL-15、IL-12或多种细胞因子的混合物。TLR激动剂主要包括TLR9、TLR4、TLR3和TLR7/8激动剂，能诱导或增强肿瘤的局部炎性反应及免疫，从而刺激体内CD8⁺T细胞的活化、IFN-γ的产生^[4]。

相较于免疫治疗药物的静脉给药，瘤内免疫注射可提高药物局部的生物利用度从而提高免疫治疗的疗效，避免脱靶毒性^[26]，降低全身毒性^[27-28]，旨在通过修饰TME、启动针对肿瘤细胞抗原的抗肿瘤免疫而使肿瘤成为自己的疫苗，产生持久的临床效益。

除了放疗和瘤内免疫注射之外，也有很多新技术例如光动力治疗（photodynamic therapy, PDT）、冷冻消融、电化学疗法、射频消融、微波消融、热高强度聚焦超声、激光消融等局部破坏性技术作为原位疫苗的临床前或临床研究的报道，但是可能无法引起强烈且持续的抗肿瘤免疫。

2 放疗联合瘤内免疫注射的临床前研究

进行单一放疗或瘤内免疫注射往往无法引起较强的抗肿瘤免疫。就放疗而言，除了已建立的高度抑制性TME持续拮抗放疗所诱导的抗肿瘤免疫效应之外^[29]，也可能因为放疗除了引起抗肿瘤免疫，本身也会通过上调TGF-β^{[19, 30]}而增加免疫抑制性CD4⁺ T细胞、促进巨噬细胞由M1型向M2型分化、抑制DCs成熟等多种途径来抑制抗肿瘤免疫^[31]。故放疗常常需要与其他免疫治疗手段联合，瘤内免疫注射就是一个极佳的选择。二者的正确联合可最大程度上实现原位疫苗效应。其中放疗通过诱导ICD启动抗肿瘤免疫，瘤内注射可注射的制剂种类较多，作用机制各不相同，联合作用于复杂的抗肿瘤免疫循环的多个环节，往往能达到令人满意的疗效。

放疗联合瘤内注射细胞因子的临床前研究主要集中于IL-12。2011年Kim等^[32]对肝癌小鼠采用25 Gy局部放疗、瘤内注射表达IL-12和GM-CSF的溶瘤腺病毒的联合治疗，观察到相对于单药治疗更高的肿瘤反应率及更低的肺转移率。其中IL-12诱导IFN产生、刺激T细胞和NK细胞活化、促进T细胞反应。GM-CSF作为特异性和持久抗肿瘤免疫最有效的刺激因子之一，上调MHC分子表达，在诱导DCs的成熟和T细胞活化中发挥重要作用。IL-12和GM-CSF联合可诱导强烈的细胞毒性T淋巴细胞反应和细胞免疫反应，二者与放疗联合，进一步发挥作为原位疫苗的抗肿瘤免疫效应。2018年Wu等^[33]对HCC小鼠进行10 Gy局部放疗和瘤内注射IL-12的联合治疗，观察到治疗部位及远隔部位肿瘤的消退，并显著延长了小鼠生存期。此实验中放疗联合瘤内注射IL-12增加了肿瘤浸润性DCs上MHCⅡ类和共刺激分子CD40和CD86的表达，并显著减少了髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）的累积并降低其免疫抑制活性，进而诱导细胞毒性T细胞的活化和扩增。2019年Mills等^[34]对胰腺癌小鼠进行5 Gy的SBRT联合IL-12微球瘤内注射的联合治疗，研究发现这种联合疗法通过启动抑制性细胞的重编程、激活大量CD8⁺T细胞并产生IFN-γ产生强大的系统性抗肿瘤免疫，不仅可以根除原发肿瘤，还能够诱发远隔效应，消除已建立的肝转移瘤。

在细胞因子方面，除了IL-12，学者们还研究了瘤内注射IL-2与放疗相联合的治疗效果。2021年Magee等^[35]对晚期转移性黑色素瘤/骨肉瘤犬进行大分割放疗联合瘤内注射hu14.18-IL2融合免疫细胞因子及放射性核素治疗，观察到以NK细胞及CD8⁺T细胞浸润为特征的肿瘤反应，也证明了这一疗法的可行性和安全性。

在免疫细胞方面，常用于瘤内注射的是DCs。2014年Byun等^[36]对纤维肉瘤小鼠采用放疗、紫杉醇化疗、瘤内注射DCs的三联治疗，观察到瘤体减小及完全消退现象。其中化放疗通过诱导促凋亡环境、促进DCs抗原递呈、促多种细胞因子及趋化因子的表达上调来增强免疫原性并形成促炎环境，在一定程度上逆转抑制性TME，降低肿瘤负荷、增加抗原暴露于DCs的概率，再瘤内注射非成熟的DCs，最终增加肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞和TH1型CD4细胞数量，促进肿瘤消退。

放疗联合共刺激分子激动剂尤其是OX40激动性抗体的瘤内免疫注射也较为常见。在抗PD-1耐药肺癌小鼠模型中，放疗后瘤内注射OX40激动剂抗体可有效抑制局部肿瘤生长、限制肺转移并提高存活率^[37]。2021年Pieper等^[38]对荷瘤小鼠（A20淋巴瘤、B78黑色素瘤、4T1乳腺癌）进行局部放疗联合瘤内注射CpG和（或）OX40激动性抗体。在未联合放疗时CpG和OX40激动性抗体并不能在冷肿瘤模型（B78黑色素瘤、4T1乳腺癌）中显著改善肿瘤反应。而联合放疗后可显著改善抗肿瘤反应、提高存活率，观察到肿瘤浸润性效应T细胞/调节性T细胞（regulatory cells, Tregs）比例增高、肿瘤引流淋巴结中CD4⁺及CD8⁺T细胞活化增加。进一步证实了这两种原位疫苗模式联合的必要性和有效性。2022年Bos等^[39]联合放疗、OX40激动性抗体、TLR3激动剂（polyIC）或TLR9激动剂，观察到局部Tregs耗竭、Tregs相关基因（FoxP3）、巨噬细胞相关基因（IL-8）、T细胞相关基因（CTLA-4）均表达下降，全身IL-7浓度升高。

为维持肿瘤局部药物的有效浓度，很多学者进行了相关的纳米粒子药物投递系统的研究^[40-43]。2021年国内Chen团队^[41]研发了一种具有良好的稳定性、低毒性和生物相容性的含FeGA纳米颗粒的可注射光控水凝胶系统，该系统的瘤内注射与放疗相联合可用于瘤内实现光热和化学动力学治疗，并产生辐射致敏作用。作为纳米材料的控释物，可实现一次给药、多次治疗的效果，有很高的临床应用潜力。2022年Zhang等^[44]开发了一种由聚赖氨酸、氧化铁和CpG组成的多功能纳米颗粒，联合放疗及ICI在冷肿瘤小鼠模型中显著提高了肿瘤反应率及总生存率。

3 放疗联合瘤内免疫注射的临床研究

在临床研究方面，开展较多的是PRR激动剂中TLR激动剂的瘤内注射。2010年Kim等^[45]对15例蕈样肉芽肿患者进行瘤内注射TLR9激动剂CpG联合局部放疗（NCT00226993），5例患者对治疗有反应，其中1例PR，并观察到Treg水平降低。同年，Brody等^[46]对15例低级别B细胞淋巴瘤患者进行瘤内注射TLR9激动剂PF-3512676联合局部放疗，结果显示7例PR、6例CR、2例SD（NCT00185965）。2018年Frank等^[47]对29例淋巴瘤患者采用瘤内注射TLR9激动剂SD-101联合放疗，结果全部观察到了肿瘤消退，且其中24例患者观察到治疗部位以外的远隔部位肿瘤的缩小，即发生了远隔效应（NCT02266147），该研究表明MHCⅡ类分子的高表达与更佳的整体临床反应呈正相关。

DCs作为抗肿瘤免疫中最主要的抗原递呈细胞，学者们也进行了很多相关临床研究。2012年Finkelstein等^[48]对17例高危软组织肉瘤患者进行EBRT联合瘤内注射DCs的新辅助治疗（NCT00365872），其中9例出现了肿瘤特异性免疫反应，研究表明肿瘤中CD4⁺ T细胞的存在与肿瘤特异性免疫反应呈正相关。2015年Kolstad等^[23]对14例Ⅲ~Ⅳ期滤泡性淋巴瘤患者进行了8 Gy放疗、瘤内注射利妥昔单抗及未成熟DCs、GM-CSF联合应用的Ⅱ期临床研究（NCT01926639），该临床试验反应率为36%（5/14），其中2例观察到持久的临床缓解。其中利妥昔单抗可以增强淋巴瘤细胞对放疗的敏感性，并且通过与表达CD20的淋巴瘤细胞结合以增强Fc受体介导的DCs的吞噬作用，促进肿瘤抗原向CD8⁺T细胞的递呈^[49]。

FMS样酪氨酸激酶3配体（FMS like tyrosine kinase 3 Ligand, Flt3L）是主要的造血祖细胞生长和分化因子，负责动员DCs，因此瘤内注射Flt3L可能是通过间接途径补充瘤内DCs的一种实用方法^[50]。2019年Hammerich等^[51]对11例低级别B细胞淋巴瘤患者进行瘤内注射Flt3L、TLR3激动剂poly-ICLC联合局部放疗的Ⅰ/Ⅱ期临床试验（NCT01976585），8例获得PR或CR。其中Flt3L招募DCs、放疗负载TAA至DCs、TLR3激动剂激活DCs，三者联合共同发挥原位疫苗的作用，诱导全身性CD8⁺T细胞抗肿瘤免疫，控制了治疗及远隔部位淋巴瘤的生长。2021年Laza-Briviesca等^[52]对29例非小细胞肺癌患者进行瘤内注射Flt3L联合放疗的Ⅱ期临床研究，其中9例观察到了远隔效应（NCT03081689）。

瘤内注射溶瘤病毒与放疗联合的临床试验也在进行之中。2020年，Monga等^[53]对30例局部晚期肉瘤患者进行术前放疗联合瘤内注射T-vec的Ⅰb/Ⅱ期临床试验（NCT02453191），可评估患者中24%（7/29）在病理学上观察到了95%的坏死，2年无进展生存期和总生存率分别为57%和88%。其中溶瘤病毒T-vec通过直接感染细胞、释放肿瘤抗原、增强针对肿瘤抗原的先天性和适应性免疫以及诱导促炎细胞因子的产生来增强抗肿瘤免疫，且该研究中溶瘤病毒作为放疗的增敏剂，放疗也能进一步增加肿瘤细胞的坏死和凋亡，二者协同增强局部及全身的肿瘤控制。同时，术前放疗联合8 ml剂量的T-vec用于软组织肉瘤患者的临床试验也正在招募之中（NCT04599062）。

除了以上常用的瘤内免疫注射药物以外，2020年Nimalasena等^[54]对12例晚期乳腺癌患者进行了放疗联合瘤内注射超生理浓度的过氧化氢的Ⅱ期临床研究（NCT02757651），耐受性良好。其中过氧化氢在超生理浓度下能诱导氧化应激和细胞毒性，于瘤内分解为氧气，可能有助于缺氧区域的复氧从而降低辐射抗性。二者联合通过诱导活性氧、炎性反应信号、DNA损伤、细胞衰老及死亡来增强抗肿瘤免疫。

4 总结与展望

ICIs虽然为肿瘤免疫治疗带来重大革新，然而新抗原负荷低、免疫细胞浸润少的“冷”肿瘤患者对ICIs的反应率不佳。肿瘤治疗性疫苗技术尤其是以上介绍的原位疫苗技术有望通过增强肿瘤局部的抗原性及佐剂性来改善这一现状，且放疗设备普及、纳入医保，技术较为成熟，瘤内免疫注射技术也在不断发展之中。虽然放疗和瘤内免疫注射的联合存在着相关研究尤其是机制方面的研究较少、最佳范式未确定、有赖于MDT和多学科合作等不足，但其联合应用从上述临床前及临床试验结果看来，具有较高的临床转化潜力和价值，有望为肿瘤患者尤其是对ICIs反应较差的复发转移性肿瘤患者的免疫治疗带来新的希望。

利益冲突声明：

所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献：

戴娟娟：文献收集与分析，论文撰写

刘宝瑞：文献分析

李茹恬：论文构思，指导论文写作