2023, Vol. 50文章信息
- 小分子抑制剂CIL56介导食管鳞状细胞癌细胞死亡
- Effect of Small-molecule Inhibitor CIL56 on Death of Esophageal Squamous Cell Carcinoma Cells
- 肿瘤防治研究, 2023, 50(7): 658-665
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2023, 50(7): 658-665
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2023.22.1447
- 收稿日期: 2022-12-06
- 修回日期: 2023-04-13
引用本文 |
2. 450000 郑州，郑州大学附属郑州中心医院药学部
2. Department of Pharmacy of Zhengzhou Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China
食管癌（esophageal cancer, EC）是常见的恶性消化道肿瘤，据2020年统计，其发病率和死亡率分别位于全球肿瘤病例的第7位和第6位[1]。在我国，食管癌的主要病理分型是食管鳞状细胞癌，目前临床上治疗食管癌的主要手段是手术切除。对于早期食管鳞状细胞癌，主要通过内镜黏膜切除术（endoscopic mucosal resection, EMR）或内镜下黏膜下剥离术（endoscopic submucosal dissection, ESD）进行治疗[2]。传统化疗也是临床上治疗食管鳞状细胞癌常用方法，常用的化疗药物有顺铂、5-Fu、多西他赛、奈达铂等[3-5]。此外，新辅助化疗、放疗以及基于PD-1/PD-L1的免疫疗法也被用于食管鳞状细胞癌（ESCC）的治疗[6]，但对于晚期食管鳞状细胞癌患者，原发肿瘤复发或转移的频率约为60%[7]，且患者的5年生存率 < 30%[8]。因此，探索低浓度且具有高抑癌作用、高特异性的化合物对食管鳞状细胞癌的治疗有着重要意义。
小分子抑制剂CIL56又称CA3，结构见图 1A。Song等研究报道小分子抑制剂CA3在体外和体内实验中均能显著抑制食管腺癌细胞的增殖，促进食管腺癌细胞凋亡[9]。本课题组通过前期筛选发现小分子抑制剂CIL56能够显著抑制食管鳞状细胞的增殖（该研究目前还未发表）。基于此，本研究以食管鳞状细胞癌TE-1、KYSE-140、KYSE-150细胞为研究对象，探讨CIL56对食管鳞状细胞癌的增殖抑制作用及相关作用机制，为CIL56在食管鳞状细胞癌中的应用提供一定的理论基础。
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| *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with 0 μmol/L CIL56. 图 1 CIL56分子式(A)及CIL56作用72h对食管鳞状细胞癌增殖(B)的影响 Figure 1 Molecular formula(A) of CIL56 and Effect of CIL56 treatment for 72h on proliferation(B) of esophageal squamous cell carcinoma |
小分子抑制剂CIL56购自陶术生物公司（货号T4309）。人食管鳞状癌细胞株TE-1、KYSE-140、KYSE-150购自中国科学院上海细胞库。总谷胱甘肽检测试剂盒（Total Glutathione Assay Kit）购自上海碧云天生物技术有限公司（货号S0052）。胎牛血清购自赛文创新（北京）生物科技有限公司（货号FSP500-12J269）、RPMI 1640基础培养基购自北京索莱宝科技有限公司（货号31800-500 ml）、铁离子比色法检测试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司（货号E1042）。xCT抗体购自艾博抗（上海）贸易有限公司（货号ab175186）、GPX4抗体购自艾比玛特医药科技（上海）有限公司（货号T56959M）、YAP1抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司（货号13584-1-AP）。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人食管鳞状癌细胞株TE-1、KYSE-140、KYSE-150均使用含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素-链霉素）的RPMI 1640培养基，在多功能生物培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）中进行培养。
1.2.2 磺酰罗丹明B比色法（SRB）取对数生长期细胞，计数后平均每孔铺3 500个细胞过夜培养（96孔板）。待细胞培养板取出后，将孔中培养基一并倒掉，每孔加入60~70 μl的10%（w/v）三氯乙酸溶液（4℃预冷），在4℃冰箱中过夜固定。用去离子水冲洗5~7次，注意不要冲到细胞，于37℃恒温烘干箱中烘干。待完全烘干后，每孔加入50 μl磺酰罗丹明B染液，室温染色30分钟。使用1%（v/v）乙酸溶液冲洗，当细胞培养板倒扣在吸水纸上无色时即可放置37℃恒温烘干箱中烘干。每孔加入100 μl的0.01 mmol/L Tris-base溶液，于全波长酶标仪中振荡10分钟，在540 nm处测定吸光度。
1.2.3 平板克隆形成实验取对数生长期细胞，计数后平均每孔铺3 000/6 000个细胞过夜培养（6孔板）。每孔各加入2 ml含药培养基，每隔3~4天换一次液，置于细胞培养箱中培养1周左右。取出后使用1×PBS（4℃预冷）清洗细胞2次，每孔加入1 ml 10%福尔马林溶液，室温固定1 h；用1×PBS（4℃预冷）清洗后，每孔加入1 ml 0.1%结晶紫溶液，室温染色30分钟后用1×PBS（4℃预冷）清洗，室温晾干后拍照记录。
1.2.4 划痕愈合实验取对数生长期细胞，计数后平均每孔铺适量细胞过夜培养（24孔板）。利用直尺作参考，使用200 μl无菌枪头沿直尺划痕，使用1×PBS（4℃预冷）清洗细胞2次，随后加入1 ml含药培养基（2%胎牛血清），于细胞培养箱中培养，在显微镜（10×物镜）下标记出划痕范围并拍照。于0、12、24、48 h拍照记录。
1.2.5 铁离子浓度检测使用0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L的CIL56处理细胞24 h后（24孔板），用1×PBS（4℃预冷）清洗细胞2遍，弃去洗液。每孔加入200 μl细胞裂解液，室温振荡裂解2 h。按照说明书配好标准品与混液A，每个1.5 ml离心管中加入100 μl混液A、100 μl的标准品/样品，混匀后于60℃水浴中加热1 h，冷却至室温后瞬离；每孔加入30 μl的铁离子检测试剂，混匀后室温孵育30分钟；取200 μl用高通量超微量分光光度计在550 nm处测定吸光度；余下细胞液做BCA蛋白浓度测定，绘制标准曲线并计算铁离子浓度。
1.2.6 总谷胱甘肽含量检测根据试剂盒说明书配制试剂和标准品。称量空管重量，胰酶消化后收集细胞，1 000 r/min、离心5分钟。使用1×PBS（4℃预冷）清洗细胞沉淀1次，待吸净PBS后称重，扣除空管重量并记录；加入细胞沉淀三倍体积的蛋白去除剂s溶液（10 mg细胞沉淀相当于10 μl），于液氮和37℃水浴中对样品进行两次快速冻融；冰上放置5分钟，4℃微量离心机、10 000 g离心10分钟，取上清并按试剂盒操作说明测定细胞总谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量。样品5倍稀释，室温孵育25分钟后在412 nm处测定样品吸光度。
1.2.7 Western blot检测细胞总蛋白提取：使用0.2、0.4、0.6、0.8 μmol/L的CIL56处理细胞24 h，弃去细胞培养液，用1×PBS（4℃预冷）清洗细胞2次，弃去洗液。加入适量的2.5×缓冲液于冰上裂解10分钟，收集到1.5 ml离心管中瞬离，100℃金属浴5~10分钟。室温冷却后，瞬离，保存在-80℃低温冰箱。
使用12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶进行电泳分离；恒流转印；0.5%脱脂牛奶（1×TBST配制）室温封闭2 h；目的蛋白一抗稀释液（0.5%脱脂牛奶配制）4℃孵育过夜，1×TBST（4℃预冷）清洗3次、10分钟/次；室温孵育相应二抗1 h（0.5%脱脂牛奶配制），使用1 ×TBST（4℃预冷）清洗3次、10分钟/次；使用ECL超敏发光液于多功能成像仪中显影。
1.3 统计学方法图像分析使用Image J软件；实验数据分析用SPSS20.0和GraphPad Prism 8软件；采用单因素方差分析或独立样本t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CIL56显著抑制食管鳞状细胞癌的细胞增殖SRB检测、光学显微镜观察和平板克隆方法检测结果显示，CIL56能显著抑制食管鳞状细胞癌的细胞增殖（均P < 0.05），且呈浓度依赖性，见图 1B, 2~3。CIL56对TE-1、KYSE-140、KYSE-150三株细胞的IC50值分别为0.502、0.534、0.908 μmol/L。
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| ***: P < 0.001, compared with 0 μmol/L CIL56. 图 2 光学显微镜下CIL56作用24h对食管鳞状细胞癌增殖作用的影响 Figure 2 Effect of CIL56 treatment for 24h on proliferation of esophageal squamous cell carcinoma under an optical microscope |
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| ***: P < 0.001, compared with 0 μmol/L CIL56. 图 3 平板克隆实验显示CIL56对食管鳞状细胞癌增殖作用的影响 Figure 3 Effect of CIL56 on proliferation of esophageal squamous cell carcinoma detected by plate-cloning method |
结合2.1三株细胞增殖实验数据，选择杀伤作用最小的浓度进行划痕愈合实验。结果显示0.2 μmol/L的CIL56能够显著抑制TE-1、KYSE-150、KYSE-140细胞的迁移，差异有统计学意义（P < 0.001）且在该浓度作用下对这三株细胞的增殖无显著影响，见图 4。
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| *: P < 0.05, ***: P < 0.001, compared with 0μmol/L CIL56. 图 4 0.2μmol/L CIL56对食管鳞状细胞癌迁移作用的影响 Figure 4 Effect of 0.2μmol/L CIL56 on migration of esophageal squamous cell carcinoma |
给予不同浓度的CIL56作用24 h，结果显示，与对照组相比，在TE-1细胞中铁离子的含量在0.4 μmol/L上升了13.29%（P < 0.05），KYSE-140在0.6 μmol/L上升了16.79%（P < 0.01），KYSE-150在0.8 μmol/L上升了33.40%（P < 0.01）。给予不同浓度CIL56作用这三株细胞12 h，结果显示，在TE-1细胞中随着CIL56浓度的增加，GSH浓度随之明显降低，而在另两株细胞中也能降低细胞内GSH浓度（均P < 0.01），见图 5。
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| *: P < 0.05, **: P < 0.01, ***: P < 0.001, compared with 0 μmol/L. 图 5 CIL56对食管鳞状细胞癌中铁离子及GSH浓度的影响 Figure 5 Effect of CIL56 on iron concentration and GSH concentration in esophageal squamous cell carcinoma |
梯度浓度的CIL56作用24 h后，TE-1、KYSE-150、KYSE-140细胞中xCT及GPX4蛋白的表达显著降低（均P < 0.05），见图 6。
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| *: P < 0.05, ***: P < 0.001, compared with 0 μmol/L CIL56. 图 6 CIL56对食管鳞状细胞癌xCT和GPX4蛋白表达的影响 Figure 6 Effect of CIL56 on xCT and GPX4 protein expression in esophageal squamous cell carcinoma |
浓度梯度的CIL56作用24 h，结果显示，CIL56明显抑制TE-1、KYSE-150、KYSE-140细胞中YAP1蛋白的表达，差异有统计学意义（均P < 0.001），见图 7。
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| ***: P < 0.001, compared with 0 μmol/L CIL56. 图 7 CIL56对食管鳞状细胞癌YAP1蛋白表达的影响 Figure 7 Effect of CIL56 on YAP1 protein expression in esophageal squamous cell carcinoma |
目前临床上食管鳞状细胞癌治疗方法主要为手术切除、放疗、化疗等。虽然这些治疗措施在不断发展和完善，但是晚期ESCC的患者预后仍不理想，总体5年生存率低。因此，探索高效、高特异性的小分子化合物对食管癌的治疗有着重要意义。我们通过前期筛选发现小分子化合物CIL56能够显著抑制ESCC细胞的增殖，促进ESCC细胞死亡。且本研究发现ESCC细胞中，给予CIL56能够下调GPX4和xCT蛋白的表达，增加细胞内Fe2+浓度、降低GSH的水平，这提示CIL56可能诱导ESCC细胞发生铁死亡。
铁死亡是一种铁离子依赖的非细胞凋亡的细胞死亡方式，伴随着膜脂质过氧化（lipid peroxidation, LPO）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）产生而引起的特定形式的细胞死亡[10]。铁死亡被诱导之后，会引起细胞形态学的改变，比如细胞体积缩小、线粒体形态发生变化，以及GSH耗竭、GPX4表达降低、ROS产生等[11]。大量研究表明，铁死亡与多种疾病的发生发展过程相关，靶向其信号通路中的关键蛋白或可成为病情缓解的关键。已有研究报道在多种肿瘤的发生与发展中，如肝癌[12]、肺癌[13]、乳腺癌[14]、胰腺癌[15]、胃癌[16]等肿瘤中铁死亡被抑制。即在这些肿瘤细胞中，胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白系统xCT被激活，GSH的代谢和CPX4的活性增加，LOP和铁离子的代谢被抑制等。因此，诱导肿瘤细胞发生铁死亡是肿瘤治疗的有效策略。
研究表明，细胞GSH耗竭或GPX4失活都能诱导铁死亡发生，从而导致细胞死亡[17-19]。CIL56被报道是铁死亡诱导剂[20]。本研究发现CIL56能够显著抑制GPX4的表达、抑制细胞中GSH的浓度。在细胞发生铁死亡时，胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白系统xCT发挥重要作用[21]。小分子化合物Erastin不可逆转地抑制xCT活性，这是其诱导铁死亡的重要机制之一。本研究中小分子化合物CIL56也能够抑制ESCC中xCT蛋白的表达，这也可能是其促进ESCC发生铁死亡的机制之一。
此外，CIL56作为一种新的YAP1蛋白抑制剂，Morice等报道，在骨肉瘤中，CIL56通过抑制YAP/Tead的转录活性，减少YAP蛋白的产生进而抑制骨肉瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡[20]。另有研究报道发现低氧能诱导YAP蛋白表达，抑制其磷酸化，增强YAP转录活性促进低氧诱导的脉络膜内皮细胞的内皮间质转变，而CA3通过抑制YAP转录活性抑制该过程[22]。此外，Delvaux等在胃肠道间质瘤细胞中，给予YAP抑制剂verteporfin能够显著减少GSH的含量和GPX4蛋白水平促进肿瘤细胞发生铁死亡，且该作用与YAP转录活性相关。而在GIST882和GIST48细胞中，给予CA3亦能诱导细胞发生铁死亡，但CA3并不抑制YAP转录活性，这提示在该过程中YAP可能不参与CA3诱导的铁死亡[23]。本研究发现CIL56能够抑制YAP蛋白的表达，这可能是其促进ESCC发生细胞死亡的机制之一。
综上所述，本研究发现小分子化合物CIL56能够显著抑制ESCC的细胞增殖及迁移，其可能的作用机制是抑制ESCC细胞中xCT蛋白的表达和GPX4蛋白的表达，增加细胞内Fe2+浓度，抑制细胞中GSH的浓度，同时抑制YAP蛋白的表达。本研究为小分子CIL56抑制剂在食管鳞状细胞癌的治疗提供一定的理论基础。
利益冲突声明：
所有作者均声明不存在利益冲突。
作者贡献：
陈嘉兴：实验过程和实验数据的收集、分析及论文撰写
许霞青：课题思路的提出及设计研究方案
张旗：论文修订
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