0 引言

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）细胞放疗敏感性差是影响患者复发和生存率下降的重要因素^[1]。大量文献报道NPC的放疗敏感性与肿瘤细胞内的基因表达有关，研究显示，MIIP、SALL4、B7-H3、miRNA-381等基因可用于增加肿瘤的放疗效果^[2-5]。Testin基因（TES）为目前研究发现的一重要抑癌基因，TES基因在鼻咽癌的发生和发展中产生何种作用、是否能调控鼻咽癌细胞的放疗敏感性等问题，一直备受关注。本课题组前期研究发现，过表达TES基因可明显抑制鼻咽癌5-8F细胞的增殖和迁移能力，并增加肿瘤细胞的放射敏感性^[6-7]。因此，本次研究主要利用转染了TES的细胞，建立裸鼠移植瘤模型，从体外动物水平观察TES对鼻咽癌5-8F细胞移植瘤放疗敏感性的影响，探索TES在鼻咽癌治疗中的作用机制。

1 材料与方法 1.1 主要材料

鼻咽癌5-8F细胞系、TES重组表达质粒均由武汉大学中南医院实验室提供；胎牛血清购自美国Gibco公司；直线加速器购自德国SIEMENS股份公司；BALB/c裸小鼠，SPF级，鼠龄5~8周，体质量（18~20）g，在武汉大学实验动物中心无特殊病原菌条件下分笼饲养。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染

选择生长状态良好的鼻咽癌5-8F细胞用于实验，将实验细胞分为两组：未转染组：未转染的5-8F细胞组；TES组：转染了高表达TES的5-8F细胞组。按照常规程序进行转染，构建高表达TES的5-8F细胞系（5-8F-pEGFP-N1-TES），并应用Western blot实验进行评估和鉴定。

1.2.2 细胞进行射线照射

将未转染组和TES组进行射线照射，照射设备为Varian2100C直线加速器，吸收剂量率400 cGy/min，放射野为10 cm×10 cm，距离100 cm，辐射剂量分别为2、4、6、8 Gy。

1.2.3 细胞克隆形成实验

常规培养下，分别将未转染组和TES组细胞暴露于不同剂量下（2、4、6、8 Gy）进行照射，照射完成后进行细胞培养10 d，去上清液、固定、洗涤晾干，计算克隆数。采用GraphPrism6.0软件，Linear-quadratic模型计算拟合剂量生存曲线。

1.2.4 裸鼠移植瘤模型建立

取对数生长期的未转染组和TES组细胞，经胰蛋白酶消化后，制备单细胞悬液，用1×PBS洗涤细胞3次，计数并用PBS重悬、调整细胞密度为4×10⁷/ml。用1 ml注射器抽取两组瘤细胞悬液分别接种于裸鼠一侧背部皮下，每个接种部位0.1 ml，含活细胞数4×10⁶个。接种一周左右开始成瘤。

1.2.5 放疗条件及实验分组

取注射瘤细胞悬液的裸鼠用直线加速器进行局部照射肿瘤，每次照射剂量为6 Gy，每三天照射一次，总剂量为18 Gy。根据是否经历局部照射，将成瘤裸鼠分为四组：未转染组：注射5-8F细胞液；TES组：注射高表达TES的5-8F细胞液；照射组：注射5-8F细胞液的成瘤小鼠经过局部照射；TES照射组：注射高表达TES的5-8F细胞的成瘤小鼠经过局部照射。

1.2.6 移植瘤生长情况

接种一周左右开始成瘤实验，每隔3天测量移植瘤裸鼠体质量，游标卡尺测量肿瘤最长直径（a）及最短直径（b），按照公式V=a×b²/2计算移植瘤体积并绘制生长曲线。接种一月后，处死小鼠，获取肿瘤组织，称重后计算抑瘤率=（对照组瘤质量-处理组瘤质量）/对照组瘤质量。

1.2.7 移植瘤中细胞凋亡情况

胰酶消化肿瘤组织制备成单细胞悬液，高速离心机2000 r/min，离心5 min；PBS缓冲液洗涤两遍，高速离心机2000 r/min，离心5 min。去上清液；加入100 μl 1×Binding Buffer缓冲液，混匀，再加入5 μl Annexin V-异硫氰酸荧光素（FITC）和5 μl碘化丙啶（PI），室温条件下孵育15 min，最后加入400 μl 1×Binding Buffer缓冲液，1 h内行流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.3 统计学方法

实验结果采用SPSS22.0统计软件分析和Gpraph Pad Prism 5进行作图、分析。本研究采用完全随机设计，所有计量数据均以x±s表示。两组间数据采取t检验，多组间数据比较采取单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Western blot实验验证转染的5-8F细胞中TES过表达

TES组中TES的表达较未转染组和空载体组明显增强，见图 1。表明过表达TES转染模型成功建立。

2.2 细胞克隆形成实验

放疗前，两组间克隆形成率差异无统计学意义（F=0.600, P > 0.05），照射后，两组间克隆形成率差异具有统计学意义（均P < 0.01），见表 1、图 2。表明TES可增加鼻咽癌5-8F细胞的放疗敏感性。

2.3 TES对裸鼠移植瘤放疗后瘤体生长速度的影响

未转染组小鼠瘤体生长速度最快；与未转染组比较，TES组、照射组、TES照射组的小鼠瘤体生长速度减慢，其中TES照射组瘤体生长速度最慢；与TES组、照射组相比较，TES照射组小鼠瘤体生长速度显著降低，且差异具有统计学意义（P < 0.01），见图 3。

2.4 TES对裸鼠移植瘤放疗后瘤体质量的影响

与未转染组比较，TES组、照射组、TES照射组的瘤体质量依次降低，抑瘤率依次升高，组间多重比较差异均有统计学意义（P < 0.01），见表 2。

2.5 流式细胞仪检测各组移植瘤中细胞凋亡情况

与未转染组比较，TES组、照射组和TES照射组的细胞凋亡率依次增加。TES照射组细胞凋亡率最高，组间多重比较差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 4。

3 讨论

鼻咽癌复发是影响患者生存率的重要因素^[8]。在这些复发的患者中，其主要原因是由于机体产生了放射抵抗，从而导致远处转移^[9]。为解决这个问题，越来越多的研究者通过植入基因来改变肿瘤细胞的内在活性，诱导细胞凋亡，从而达到增加放射敏感性的效果^[10]。

Testin基因（TES）为目前研究发现的一个重要的抑癌基因，它位于染色体易断裂区域7q31.1/2，在大部分恶性肿瘤中显示为杂合型缺失^[11]。该基因的表达缺失与癌症密切相关，研究发现，Testin基因在多种恶性肿瘤如胃癌、肺癌、淋巴瘤、脑星形细胞瘤、结直肠癌等中表达降低，并且与肿瘤患者的不良预后密切相关，而高表达TES则明显抑制恶性肿瘤细胞的增殖、促进其凋亡^[12-17]。这与本课题组前期研究结果一致，TES在鼻咽癌组织中表达下降^[18]，并且可明显抑制鼻咽癌5-8F细胞的增殖、促进其凋亡^[5-6]。有研究发现，高表达TES可能通过作用于一种细胞骨架调节因子Mena，从而抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和阻滞肿瘤的细胞周期，并且在体外裸鼠实验中抑制胃癌细胞的成瘤性^[19]。Dong等^[20]研究发现TES通过诱导肿瘤细胞凋亡，减少细胞增殖，将肿瘤细胞停滞在细胞G₁期，从而增加子宫内膜癌细胞的凋亡、抑制肿瘤的转移及浸润。同样，Wang等^[21]通过流式细胞术揭示了过表达TES可诱导小细胞肺癌细胞凋亡。此外，他们还发现过表达TES对裸鼠体内小细胞肺癌移植瘤形成和生长的抑制作用；相反，TES蛋白表达的减少会增加细胞运动性，减少细胞与细胞之间的接触，因此，TES被认为可能是恶性肿瘤转移的生物标志物^[22]。

迄今为止，TES在头颈部肿瘤的研究报道较少，尤其在鼻咽癌细胞放疗敏感性方面的作用尚未报道。我们通过细胞克隆形成实验，分析过表达TES的鼻咽癌5-8F细胞株的放疗敏感性，研究结果显示，TES细胞经照射后，细胞的存活率明显降低（P < 0.01），说明TES可提高鼻咽癌5-8F细胞的放疗敏感性。为了深入研究TES影响鼻咽癌5-8F细胞放疗敏感性的发生机制，我们建立鼻咽癌5-8F细胞裸鼠移植瘤模型，结果显示，与未转染组比较，TES组、照射组和TES照射组瘤体生长速度依次减慢（P < 0.05），瘤体质量依次降低，细胞凋亡率依次增加。其中，TES照射组瘤体生长速度最慢、质量下降最大、细胞凋亡率最高。这些结果均提示，TES基因可有效提高鼻咽癌5-8F细胞的放疗敏感性，也提示TES可能是调控鼻咽癌放疗敏感性相关的重要因子。

综上所述，高表达Testin基因（TES）可提高鼻咽癌的放疗敏感性，下一步我们将对TES的作用分子机制进行深入研究，希望能为临床应用及鼻咽癌的靶向治疗带来新的思路。

利益冲突声明:

所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献：

钟准：设计研究方案，实验操作，收集与统计数据，撰写论文

费永光：收集并整理数据，协助实验操作及数据分析，文稿修改