0 引言

肝癌在人类癌症死因排名中占据第三^[1]，中医学将“肝癌”归属于“肝积”、“积聚”、“癥瘕”等范畴。《素问·刺法论》曰：“正气存内，邪不可干”。黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ, AS-Ⅳ）为黄芪提取物中的一种，具有抑制氧化应激、减少炎性反应、促进内皮细胞成管、促进梗死区域血管再生、促进干细胞向血管内皮细胞分化的作用^[2]，同时也具有补益正气的效果。另有研究^[3]表明，黄芪甲苷能诱导人结肠癌SW480细胞凋亡，但其抗癌机制尚有待深入研究。本研究以VEGF信号通路为切入点，探讨黄芪甲苷对HepG2细胞的作用及其可能机制。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

人肝癌细胞株HepG2细胞（由兰州大学基础医学院提供）、黄芪甲苷（成都普瑞法科技开发有限公司，型号：84687-43-414）、胎牛血清（型号：C2800 0500）、100 u/ml青霉素G/100 μg/ml链霉素的DMEM完全培养基（型号：SH30023，美国赛默飞公司）、CCK-8（中国爱普拜公司，型号K1018）、TRIzol Servicebio^®RT First Strand cDNA Synthesis Kit（武汉赛维尔公司，G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix（武汉赛维尔公司, G3320）。

1.2 方法

1.2.1 黄芪甲苷靶点获取

PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）^[4]数据库检索Astragaloside Ⅳ，获取其2D结构，并在SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）^[5]、Genecards^[6]及PharmMapper（http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/）^[7]数据库中检索Astragaloside Ⅳ，以Homo Sapiens为类别，去重后得到373个黄芪甲苷靶点。

1.2.2 肝细胞癌靶点基因及样本获取

从TCGA^[8]中下载肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）相关的mRNA和表达量数据、转录组分析、基因表达量和RNA表达量数据（2020.08.02）。

1.2.3 黄芪甲苷与肝细胞癌“药物-疾病”共靶点

在TCGA数据库中获取HCC患者的RNA-seq数据，以|log₂FC| > 1，FDR < 0.05为分界标准，分析HCC组织与正常组织间的差异表达基因，构建差异基因热图；运用Venn Diagram，构建AS-Ⅳ作用靶点及HCC差异基因对应靶点交集，即为AS-Ⅳ作用于HCC的“药物-疾病”共靶点。

1.2.4 黄芪甲苷作用于肝细胞癌的蛋白互作网络分析

在STRING（https://string-db.org/）^[9]中检索“药物-疾病”共靶点，以Homo sapiens为种属，调整high confidence为0.4和0.7，得出蛋白互作网络图（protein-protein interaction network, PPI），分析出相关系数最大的基因，即为AS-Ⅳ作用于HCC的核心基因。

1.2.5 构建黄芪甲苷-肝细胞癌网络药理图

将PPI蛋白相互作用的结果、节点和基因列表导入Cytoscape（Cytoscape_v3.7.0）^[10]，调整结合度，构建AS-Ⅳ作用于HCC的网络药理图。

1.2.6 模拟黄芪甲苷与核心基因的分子动力学作用

选用PyRx0.8虚拟筛选工具作为对接程序，AutoDock Vina（Auto DockTools-1.5.6）作为对接引擎^[7]，从PubChem数据库下载黄芪甲苷结构，使用ChemBio3D（ΜLtra 14.0）软件构建分子，并通过MM2分子力学优化化合物构型（依次选择CalcuLations/MM2/Minimize Energy）；然后从RCSB Protein Data Bank（https://www.rcsb.org）下载VEGFA蛋白的三维结构，并在蛋白与化合物中添加所有的氢原子、计算Gasteiger电荷、合并非极性氢原子；最后确定Vina分子对接的坐标和盒子大小，将参数exhaustiveness设置为20。AutoDock Vina进行半柔性对接，选取affinity最佳的构象，并使用PyMOL及Discovery studio进行作图。amber20软件包对分子对接获取的蛋白-小分子复合物进行分子动力学模拟。蛋白使用ff14SB力场参数，AS-Ⅳ小分子配体则使用gaff通用力场参数，并使用ANTECHAMBER模块计算其AM1-BCC原子电荷。分子动力学模拟工作流程共包括能量最小化、加热、平衡、生产动力学模拟等4步。首先，约束蛋白（和小分子）重原子，对水分子进行10 000步（含5000步最速下降法和5 000步共轭梯度法）能量最小化；随后，在50 ps时间内，将反应体系缓慢加热至300 K；加热完成后，在NPT系综下对体系进行50 ps的平衡。最后，将体系在NPT系综下进行50 ns的分子动力学模拟。每隔20 ps保存一次轨迹数据，并用CPPTRAJ模块进行相关分析。配体和蛋白的结合自由能计算则采用MMPBSA.py模块进行。结合自由能计算公式：ΔG_bind=G_complex–G_protein–G_ligand，对蛋白与小分子配体的自由结合能进行计算。RMSD曲线代表了蛋白构象的波动情况。其中N是原子数，mi是原子i的质量，Xi是目标原子i的坐标矢量，Yi是参考原子i的坐标矢量，M是总质量。

1.2.7 差异基因富集分析

结合R语言，以P < 0.05为标准，以q < 0.05对P值过滤，对“药物-疾病”共靶点进行GO、KEGG富集分析，并将富集结果可视化。

1.2.8 黄芪甲苷含药培养基的制备

将0.3 g黄芪甲苷溶解于1 ml DMSO中，用完全培养基配成30 μg/μl原液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，置-20℃冰箱保存备用，实验时用完全培养基稀释至所需质量浓度的应用液（DMSO所占体积比小于1‰）。

1.2.9 细胞培养及分组

人肝癌HepG2细胞保存在添加有胎牛血清和双抗的DMEM培养基中，置于37℃和5%CO₂的湿化培养箱中培养；HepG2细胞分为对照组（DMEM组）与低（45 μg/ml）、中（90 μg/ml）、高（180 μg/ml）浓度AS-Ⅳ组（DMEM+AS-Ⅳ组）。

1.2.10 细胞存活率测定

CCK-8法评估AS-Ⅳ对HepG2细胞生长影响，并确定AS-Ⅳ对HepG2细胞存活率影响的量效及时效值。

1.2.11 克隆形成实验

取对数生长期的各组细胞，制备细胞悬液。将细胞悬液作梯度倍数稀释，分别接种细胞（500个）于含培养液的培养皿中，当培养14天时，培养皿中出现肉眼可见的克隆，终止培养。弃去上清液，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，采集数据。

1.2.12 细胞迁移实验

细胞生长于含10%FBS DMEM培养基中，以每孔1×10⁶个接种到6孔培养板中，生长24 h后，当单层细胞融合度达70%~80%，用新的200 μl枪头在单层培养细胞间划痕，弃培养液，PBS清洗，对照组加4 ml DMEM全培养基，实验组加等量体积的低、中、高浓度AS-Ⅳ，继续培养48 h，去培养液，采集数据。

1.2.13 细胞侵袭实验

将HepG2细胞接种于上室，对照组加入无血清DMEM培养基，实验组分别加入含低、中、高浓度AS-Ⅳ的无血清DMEM培养基，下室均加入等量DMEM完全培养基，继续培养细胞48 h后，通过固定染色Transwell小室底部，并计算迁移至下室的细胞数。

1.2.14 流式细胞术

对照组加DMEM完全培养基，实验组用低、中、高浓度AS-Ⅳ处理48 h后，收获HepG2细胞，用70%冰冷乙醇4℃固定24 h，PBS洗涤，再悬浮在1 ml PI染色液（40 μg/ml RNaseA和10 μg/ml PBS）中，室温黑暗中孵育30 min，测细胞周期占比；然后用FITC和PI染色液对用不同浓度AS-Ⅳ处理后的HepG2细胞进行双染，室温黑暗中孵育30 min，测细胞凋亡占比。

1.2.15 qRT-PCR

根据产品说明书，TRIzol提取细胞总RNA，Servicebio^®RT First Strand cDNA Synthesis Kit合成cDNA，2×SYBR Green qPCR Master Mix用于进行VEGFA、TGF-β1和GAPDH基因的定量检测。引物序列为：GAPDH：正义：GGAAGCTTGTCAT CAATGGAAATC，反义：TGATGACCCTTTTGGCTCCC；VEGFA：正义：GGAGGGCAGAATCATCACGA，反义：GATCATCTCCCTATGTGCTGG；TGF-β1：正义：CAGCAACAATTCCTGGCGATA，反义：GCTAAGGCGAAAG CCCTCAAT。结果处理ΔΔCT法：A=CT_{AS-Ⅳ干预后目的基因}－CT_{AS-Ⅳ干预后内参基因}，B=CT_{无AS-Ⅳ干预目的基因}－CT_{无AS-Ⅳ干预内参基因}，K=A－B，相对表达量=2^-K。

1.3 统计学方法

数据以（x±s）表示，多组和成对的比较采用GraphPad软件（9.0版）的单因素方差分析（ANOVA），两两比较方差齐时采用最小显著差异法t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 黄芪甲苷2D和3D结构模型建立

将黄芪甲苷在PubChem BioAssay数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/bioassay）对话框中进行检索获取其2D结构，将其2D结构式在软件ChemBio3D ΜLtra 14.0上进行导入，导出其3D结构式。

2.2 构建黄芪甲苷与肝细胞癌的“药物-疾病”共靶点

分析AS-Ⅳ的靶点与肝细胞癌-正常组织中差异表达基因对应靶点的交集，并行差异分析，得出27个差异交集靶点：CSTN、HSP90AA1、VEGFA、CDK1、LGALS3、ADRA2B、ADRA1A、TYMS、SF3B3、SRC、F11、F7、ATP1A1、MMP1、ADAM17、SELP、GBA、EGLN3、TGFB1、PPARG、BAX、RAC1、CTNNB1、SMAD2、GSK3B、SIRT6、PPAT，即为AS-Ⅳ作用于HCC的“药物-疾病”共靶点。

2.3 “药物-疾病”共靶点互作网络分析

通过在STRING上构建PPI蛋白互作网络图, 筛选与“药物-疾病”共靶点中关联最密切且节点最多的靶点，标记为核心靶点，见图 1A，PPI蛋白网络互作图提示：AS-Ⅳ作用于HCC核心靶点为VEGFA。

2.4 “药物-疾病”共靶点差异分析

根据“药物-疾病”共靶点在每个样本中表达情况，以FDR=0.05、log₂FC=0为基准，构建27个差异基因热图，见图 1B，结果显示：核心基因VEGFA为下调基因。

2.5 “药物-疾病”共靶点互作网络药理图

明确“药物-疾病”共靶点，并根据共靶点蛋白PPI互作网络及节点的多少，用degree进行区分节点，并用label注释，构建AS-Ⅳ作用于HCC的网络药理图，结果显示：靶点VEGFA的degree值最大，且节点最多。

2.6 黄芪甲苷与核心蛋白的分子动力学模拟分析

为了从分子水平阐明VEGFA蛋白与化合物AS-Ⅳ的作用模式，将化合物对接至蛋白，其对接打分为-6.8 kcal/mol，且与之结合的氨基酸有LYS107、LEU66、ASP63、LEU32、VAL33，另分子动力学模拟中，以分子对接构象为基准，比较分子对接分子自由结合能与分子动力学自由结合能示意图，结果显示：Pro70（Ⅴ）、Cyx68（Ⅴ）为其共同结合氨基酸。在模拟的初始阶段（0-5000 ps）构象存在一定变化，VEGFA蛋白的RMSD波动稍大（图 2A）。但5 000 ps以后，RMSD曲线趋于平稳，蛋白构象逐渐稳定，而AS-Ⅳ小分子的RMSD波动情况则与之相反（图 2B），说明AS-Ⅳ小分子配体与VEGFA蛋白结合后，动力学模拟过程中，AS-Ⅳ小分子RMSD存在波动，但分子对接与分子动力学模拟过程中具有共同自由结合能Pro70（Ⅴ）和Cyx68（Ⅴ），故分子动力学模拟进一步验证了分子对接的可行性。

2.7 GO与KEGG富集分析

差异基因GO富集分析发现，前30种功能富集涉及血压调节、血管重构、血管直径的调节等，见图 2C；KEGG富集分析发现与肝细胞癌相关及与核心基因相关的信号通路，即Hepatocellular carcinoma（hsa05225）信号通路和VEGF（ko04370）信号通路，而与之相关的核心基因为TGF-β1和VEGFA，见图 2D。

2.8 细胞增殖测定

CCK-8法检测HepG2细胞的增殖能力，与对照组相比，当AS-Ⅳ浓度为180 μg/ml时，干预48 h，HepG2细胞增殖能力最弱；当AS-Ⅳ的浓度为180 μg/ml时，干预时间分别为24、48、72 h时，HepG2细胞存活率分别为84%、57.5%、72%（t=33.98, P=0.0000; t=39.28, P=0.0000; t=20.15, P=0.0000），见图 3A。

2.9 细胞迁移、侵袭及克隆实验

与对照组相比，低、中、高浓度AS-Ⅳ干预48 h时，迁移实验中，AS-Ⅳ处理组HepG2细胞的划痕愈合率分别为37%、19%、18%，提示其对肿瘤的迁移有抑制作用（t=2.793, P=0.0234; t=135.12, P=0.0000; t=48.27, P=0.0000），见图 3B；侵袭实验中，AS-Ⅳ处理组HepG2细胞侵袭相对抑制率分别为1.7%、27.1%、55.7%，（t=4.892, P=0.0012; t=12.80, P=0.0000; t=16.84, P=0.0000），见图 3C；克隆形成实验中，AS-Ⅳ处理组HepG2细胞的克隆形成率分别为4.8%、4.2%、2.1%（t=3.078, P=0.0217; t=7.416, P=0.0003; t=17.22, P=0.0000），见图 3D。

2.10 细胞凋亡与周期检测

与对照组相比，低、中、高浓度AS-Ⅳ干预48 h时，HepG2细胞凋亡率分别为2.43%、15.58%、21.46%（t=0.9571, P=0.3927; t=38.44, P=0.0000; t=50.60, P=0.0000），见图 4A、C。细胞周期分布情况见图 4B、D，其中G₁期占比分别为38.22%、44.9%、50.94%（t=0.3163, P=0.7676; t=7.954, P=0.0014; t=14.80, P=0.0001）。

2.11 qRT-PCR实验

与对照组相比，低、中、高浓度AS-Ⅳ干预48 h时，VEGFA mRNA的相对表达量分别为1.72、1.5、1.12（t=0.09923, P=0.9257; t=2.685, P=0.0549; t=5.351, P=0.0059），见图 4E；基因TGF-β1 mRNA相对表达量为1.12、1.44、1.80（t=0.8347, P=0.4508; t=14.21, P=0.0001; t=7.154, P=0.0020），见图 4F。

3 讨论

网络药理学与分子对接为阐明成分-靶点和靶点-疾病之间网络的分子机制和成分-蛋白自由结合能力提供了一个新的视角^[11-12]，这与中医药的“多成份”、“多靶点”和“多通路”的特点相适应；分子动力学模拟为实验前期提供了一个依据与可行性分析，同时也为阐述肝细胞癌的发病机制提供了可能；肝癌在中国的癌症发生率中占第四位，死亡率中占第三位^[13]，且肝细胞癌约占所有肝癌的90%^[14]，其病因与病毒性肝炎、黄曲霉毒素B1、酒精及遗传等因素相关，其发病机制多与P53、WNT/β-catenin、氧化应激、pI3K/AKT/MTOR通路及微生物群等相关^[15]，治疗以手术、化疗、放疗、生物免疫治疗等为主，但总体疗效较差。Hepatocellular carcinoma信号通路作为肝细胞癌主要信号通路之一，且与之相关的重要基因为TGF-β1，本研究通过数据挖掘及模拟，分析出AS-Ⅳ作用于肝细胞癌的核心基因为VEGFA，其过表达可以引发肿瘤细胞的增殖、转移和血管生成^[16-17]，VEGFA激活VEGFR2的磷酸化，在体外促进血管内皮细胞的成管、细胞迁移和侵袭^[18]；AS-Ⅳ作用于肝细胞癌的信号通路主要为VEGF信号通路及Hepatocellular carcinoma信号通路，而与之相关的核心基因为VEGFA与TGF-β1，所以AS-Ⅳ对肝细胞癌的靶向作用可能主要体现在对这两个基因的影响上。CCK-8实验、伤口愈合实验、克隆形成实验及细胞侵袭实验提示其有抑制HepG2细胞增殖和迁移、侵袭的能力，且能促进其凋亡，抑制其从G1期向G2期转移，也即抑制增殖所需蛋白的合成进而抑制其增殖；此外，AS-Ⅳ能抑制核心基因VEGFA表达和促进基因TGF-β1表达，其中基因VEGFA的过表达对肿瘤细胞的迁移、增殖、侵袭及血管的生存具有促进作用，同时基因TGF-β1能调节细胞增殖、生长、分化和运动，故其共同参与影响HepG2细胞的增殖。

综上，AS-Ⅳ对HepG2细胞增殖具有一定抑制作用，其机制可能与抑制HepG2细胞增殖、迁移、侵袭，并促进其凋亡有关，这个过程可能是通过促进基因TGF-β1 mRNA表达和抑制VEGF信号通路中基因VEGFA表达共同完成的。但本研究也存在一定的局限性，需进一步观察AS-Ⅳ对相关蛋白表达的影响以及体内实验进行验证。

作者贡献：

周志朋：实验设计与实施、文章撰写、基金项目申请

杨明珠：采集数据

蔡明钦：实验实施、分析、解释数据

薛娟娣：统计分析

吕晓云：文章审阅、研究经费支持、文章指导