2022, Vol. 49文章信息
- LINC00649通过miR-424-5p/IGF1R轴调控内质网应激介导的宫颈癌细胞凋亡
- LINC00649 Regulates Endoplasmic Reticulum Stress-mediated Cervical Carcinoma Cell Apoptosis via miR-424-5p/IGF1R Axis
- 肿瘤防治研究, 2022, 49(2): 101-109
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2022, 49(2): 101-109
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2022.21.0597
- 收稿日期: 2021-05-28
- 修回日期: 2021-08-10
引用本文 |
2. 266100 青岛，青岛市第八人民医院妇科
2. Department of Gynaecology, Qingdao Eighth People's Hospital, Qingdao 266100, China
宫颈癌（cervical carcinoma, CC）是女性生殖系统常见的妇科恶性肿瘤[1]。尽管早期CC可以通过手术或放疗进行治疗，但部分晚期CC患者的预后仍然较差[2-3]。因此，阐明CC在临床上的分子机制尤为重要。
有研究表明，长链非编码RNA（lncRNAs）是一种在表观遗传、转录或翻译水平上调控基因表达的基因组非编码转录物，在疾病进展中起着重要作用[4]。因此，lncRNAs被用来作为各种癌症诊断和预后分析的生物标志物，LINC00649被确定为前列腺癌和结直肠癌的预后标志物[5]，但并无与CC相关的报道。miR-424-5p的异常表达在各种肿瘤中均有报道，其在CC组织和细胞中显著降低，过表达miR-424-5p可抑制CC细胞增殖，促进细胞凋亡[6]。此外，生物信息学预测表明miR-424-5p可靶向胰岛素样生长因子受体1（IGF1R）。IGF1R是一种跨膜受体酪氨酸激酶。有研究发现，miR-375能靶向IGF1R抑制CC细胞增殖和迁移，促进细胞凋亡[7]。
本研究旨在探讨LINC00649是否通过海绵吸附miR-424-5p上调IGF1R的表达，进而参与调控内质网应激（endoplasmic reticulum stress, ERs）过程，以调节CC细胞增殖和凋亡。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂正常宫颈上皮细胞系H8和HeLa、MS750、Caski、SiHa四株CC细胞系均购自美国ATCC细胞库。Lipofectamine 3000（L3000001）、TRIzol试剂（15596026）和PARISTM试剂盒（AM1921）购自赛默飞世尔科技公司。CCK-8试剂盒（CA1210）购自北京索莱宝科技有限公司。AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（S0185XL）购自上海雅集吉生物科技有限公司。RIPA裂解缓冲液（MT0065）和双荧光素酶报告基因检测试剂盒（YBP165）购自北京百奥莱博科技有限公司。实验所用抗体均购自英国Abcam公司。反转录试剂盒（K1622）和ABI 7500系统（4351104）购自北京智杰方远科技有限公司。ECL试剂盒（AS16-ECL-SN）购自艾美捷科技有限公司。流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司。
1.2 方法 1.2.1 生物信息学分析从NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取CC相关芯片表达数据，选择GSE55478分析差异表达miRNAs。该芯片中包含3例CC组织及对应的正常子宫颈组织。筛选条件为校正后P值< 0.05和|LogFoldChange| > 1，miRNAs注释平台为GPL18358 Agilent-041686 Unrestricted Human miRNA Microarray（miRNA ID version）。RNA22（http://cm.jefferson.edu/rna22/）和StarBase（http://starbase.sysu.edu.cn/index.php）在线预测网站用于预测miR-424-5p的上游靶点。GEPIA数据库（http://gepia.cancer-pku.cn）用于预测LINC00649在CC中的表达及生存曲线。TargetScan（http://targetscan.org/vert_72/）、miRDB（http://mirdb.org）和miRWalk（http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de）用于预测miR-424-5p的下游靶基因。DAVID（http://david.ncifcrf.gov）数据库用于基因的KEGG功能富集分析，并将P < 0.05的生物学通路绘制条形图。DisGeNET（http://disgenet.org）数据库获取CC（CUI：C1334177）的疾病风险基因，筛选条件为GDA Score≥0.05。STRING（http://string-db.org）用于分析蛋白间的互作用关系。
1.2.2 组织采集从中国人民解放军海军第971医院妇产科获取2018年4月—2020年12月的58例CC患者的肿瘤组织及其配对邻近正常组织（肿瘤周围2~5 cm）。患者年龄范围为29~63岁，平均年龄为51.2±4.8岁，根据国际妇产科联合会（FIGO）标准进行病理分级和临床分期，其中Ⅰ~Ⅱ期34例，Ⅲ~Ⅳ期24例。纳入标准：（1）经组织病理学检查证实；（2）未接受免疫治疗、化疗或放疗；（3）愿意捐献组织活检。排除标准：（1）有其他恶性肿瘤病史；（2）CC复发；（3）心脏、肾脏和其他器官衰竭；（4）免疫性疾病；（5）孕妇或哺乳期妇女。收集所有样品，在液氮中快速冷冻，并在使用前保存在−80℃环境下。所有患者均签署书面知情同意书。研究方案经本院伦理委员会批准。
1.2.3 细胞培养在RPMI 1640培养基中培养正常宫颈上皮细胞系H8和4株CC细胞系，添加10%胎牛血清（FBS）及青霉素（100 u/ml）和链霉素（100 μg/ml）。所有细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养。
1.2.4 细胞转染设计并合成针对LINC00649的特异性小干扰RNA（siRNAs）以敲减LINC00649，以si-NC作为阴性对照。获取miR-424-5p模拟物（miR-424-5p mimic）、NC对照物和miR-424-5p抑制剂（miR-424-5p inhibitor）。为过度表达IGF1R，将IGF1R序列插入pcDNA3.1质粒中以获得IGF1R过度表达质粒pcDNA3.1-IGF1R。CC细胞接种于6孔培养板中，在37℃、5%CO2培养箱中培养。使用Lipofectamine 3000将siRNA（100 pmol）、miRNA模拟物（100 pmol）、miRNA抑制剂（100 pmol）或质粒（4 μg）转染HeLa细胞。
1.2.5 CCK-8检测24 h后收集转染细胞，培养基添加10%FBS，悬浮细胞。将含有2×103个细胞的100 μl悬液接种到96孔板中，在上述条件下分别培养0、24、48和72 h，每孔添加10 μl CCK-8试剂，37℃再培养2 h。使用微孔板分光光度计测量450 nm波长处吸光度值。
1.2.6 流式细胞术检测使用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒，用不含EDTA的胰蛋白酶处理细胞，离心后收集细胞，用预先培养的PBS洗涤，细胞浓度调整至（1~5）×105/ml。用100 μl 1×结合缓冲液悬浮。添加5 μl AnnexinV-FITC和10 μl PI染色液，轻轻混合。室温下避光反应10~15 min。加入400 μl 1×结合缓冲液混合，置于冰上。1 h内用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.7 Western blot检测收集转染后的细胞，RIPA裂解缓冲液和2%蛋白酶抑制剂混合液分离总蛋白。BCA法测定蛋白浓度。蛋白质通过10%SDS-PAGE电泳分离，转移到0.45 µm PVDF膜。5%脱脂奶粉37℃封闭膜1 h，4℃一抗孵育过夜。在ECL试剂盒检测之前，将膜与辣根过氧化物酶（HRP）结合的二抗IgG（1:2 000）37℃摇床孵育1 h。使用ImageJ软件通过密度测定法测量蛋白质表达水平。实验所用一抗有：GRP78（1: 1 000）、CHOP（1:1 000）和Caspase-12（1:1 000），GAPDH（1:1 000）为内参。
1.2.8 qRT-PCR检测使用TRIzol试剂从CC组织或细胞中提取总RNA，并使用反转录试剂盒合成cDNA。ABI 7500系统上使用SYBR-Green试剂进行qRT-PCR检测。GAPDH和U6分别作为LINC00649和IGF1R、miR-424-5p的内参。2-ΔΔCt法分析各标本的相对基因表达。引物序列见表 1。
将LINC00649（WT-LINC00649）或IGF1R（WT-IGF1R）的3’UTR野生型序列及其相应的突变型（MUT-LINC00649或MUT-IGF1R）序列克隆到pGL4荧光素酶报告质粒中。将报告质粒（WT-LINC00649、WT-IGF1R、MUT-LINC00649或MUT-IGF1R）与miR-424-5p模拟物共转染HeLa细胞。转染48 h后，用双荧光素酶报告试剂盒检测荧光素酶活性。
1.2.10 核质分离试验使用PARISTM试剂盒，收集HeLa细胞（1×107个/孔），悬浮在细胞组分缓冲液中进行细胞质和核分离，置于冰上10 min。按照试剂盒使用说明书，4℃下5 000 g离心30 s，细胞裂解缓冲液分离上清液和核组分，提取RNA并进行qRT-PCR检测。
1.3 统计学方法采用SPSS22.0软件进行数据分析，所有数据均表示为平均值±标准差（x±s）。计数资料以n表示，采用卡方检验或Fisher确切概率检验进行检验。在计量数据符合正态分布的前提下，采用t检验分析两组间的差异，使用单因素方差分析比较多组间的差异。在不符合正态分布条件下，两组间使用曼-惠特尼U检验，采用Tukey检验进行事后比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 生物信息学预测结果对GSE55478数据集中的miRNAs进行差异表达分析，根据CC组织中miRNAs较正常子宫颈组织中的差异表达倍数，选择CC组织中显著下调的前5个miRNAs绘制热图，见图 1A。由于miR-424-5p在CC中的作用已得到初步明确[6]，对miR-424-5p进行下一步分析。在StarBase和RNA22获取miR-424-5p的上游靶点并取交集，结果为CERS6-AS1、LINC00649、GABPB1-AS1、UBA6-AS1和EPB41L4A-AS1。GEPIA数据库发现LINC00649在CC组织中的表达显著高于癌旁正常组织，见图 1B，推测LINC00649在CC中的异常表达可能发挥调控作用。LINC00649和miR-424-5p的结合位点见图 1C。在TargetScan、miRWalk和miRDB获取miR-424-5p的下游靶点并取交集，共有479个共同靶基因，随后进行KEGG功能富集分析，选取FDR（校正后P值） < 0.05的生物学通路绘制成条形图，见图 1D，其中有较多基因显著富集在癌症相关的生物学通路：hsa05200:Pathways in cancer，将该生物学通路中的基因与DisGeNET数据库获取的CC疾病风险基因通过STRING在线预测网站进行蛋白互作用分析，见图 1E，并根据以往的研究，选择IGF1R进行后续分析。IGF1R和miR-424-5p的靶向结合位点见图 1F。
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| A: five miRNAs significantly down-regulated in cervical carcinoma (CC); B: prediction results of LINC00649 in GEPIA database; C: binding sites of LINC00649 and miR-424-5p; D: KEGG analysis results; E: protein-protein interaction diagram; F: specific binding sites of miR-424-5p and IGF1R. 图 1 生物信息学工具预测结果 Figure 1 Prediction results of bioinformatics tools |
与邻近正常组织相比，CC组织中的LINC00649表达水平显著上调（P < 0.05），见图 2A。ROC曲线下面积（AUC）为0.8639（P < 0.0001），见图 2B。此外，与H8细胞相比，LINC00649在CC细胞系中的表达增加，且在HeLa细胞中表达水平最高，后续选择HeLa细胞进行实验（均P < 0.05），图 2C。LINC00649的表达水平与FIGO分期、淋巴结转移和肿瘤分期有关。未发现LINC00649水平与年龄、肿瘤大小、组织学类型和分化程度之间的相关性，见表 2。
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| A: expression of LINC00649 in CC and adjacent normal tissues (n=58); B: ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of LINC00649; C: expression of LINC00649 in H8 cell lines and CC cell lines (HeLa, MS750, Caski, SiHa). *: P < 0.05, compared with H8 cell line. 图 2 LINC00649在宫颈癌组织和细胞中的表达及其与宫颈癌患者预后的关系 Figure 2 LINC00649 expression in CC tissues and cells as well as its relation with prognosis of CC patients |
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用LINC00649 siRNA及其阴性对照转染HeLa细胞，qRT-PCR结果显示，转染后LINC00649的表达水平显著降低（P < 0.05），见图 3A。CCK-8法和流式细胞仪检测结果显示，敲减LINC00649后，细胞增殖活力显著降低，细胞凋亡数目增加（均P < 0.05），见图 3B~C。Western blot检测发现LINC00649的下调促进了GRP78、CHOP和Caspase-12的蛋白表达（均P < 0.05），见图 3D~E。
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| A: the expression of LINC00649 was detected by qRT-PCR; B: the results of cell proliferation were detected by CCK-8; C: cell apoptosis was detected by flow cytometry; D, E: ER-related proteins expression were detected by Western blot. *: P < 0.05, compared with si-NC group. 图 3 敲减LINC00649可促进ERs并加速CC细胞凋亡 Figure 3 Knockdown of LINC00649 could promote ERs and accelerate CC cell apoptosis |
核质分离实验结果显示LINC00649主要定位于细胞质，可以稳定发挥竞争性内源RNA的作用（P < 0.05），见图 4A。双荧光素酶报告实验证实miR-424-5p为LINC00649的下游靶点，miR-424-5p mimic可显著抑制WT-LINC00649的荧光活性，而对MUT-LINC00649的荧光活性几乎没有影响（P < 0.05），见图 4B。qRT-PCR检测发现miR-424-5p在CC组织中显著下调（P < 0.05），见图 4C，且与LINC00649负相关（P=0.0281），见图 4D。此外，miR-424-5p在CC细胞系中的表达较H8显著降低（P < 0.05），在HeLa细胞中表达最低，见图 4E，敲减LINC00649可显著上调miR-424-5p的表达（P < 0.05），见图 4F。
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| A: subcellular localization of LINC00649 was detected by nucleocytoplasmic separation test; B: results of dual luciferase reporter assay; C: the expression of miR-424-5p in CC was detected by qRT-PCR; D: correlation analysis results of LINC00649 and miR-424-5p in CC tissue; E: qRT-PCR was used to detect the expression of miR-424-5p in H8 cell lines and CC cell lines (HeLa, MS750, Caski, SiHa). *: P < 0.05, compared with H8 cell line; F: the effect of LINC00649 on miR-424-5p expression in HeLa cells. #: P < 0.05, compared with si-NC group. 图 4 miR-424-5p是LINC00649的靶点 Figure 4 miR-424-5p was the target of LINC00649 |
qRT-PCR检测结果显示，si-LINC00649显著升高的LINC00649水平被miR-424-5p inhibitor部分抑制（P < 0.05），见图 5A。细胞增殖和凋亡检测结果显示，敲减LINC00649抑制细胞增殖活力，诱导细胞凋亡，而miR-424-5p inhibitor的转染显著促进了HeLa细胞的增殖活力，减少了凋亡细胞（均P < 0.05），图 5B~C。此外，敲减LINC00649上调的GRP78、CHOP和Caspase-12被miR-424-5p inhibitor部分抑制（均P < 0.05），图 5D~E。
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| 1: Control; 2: si-NC; 3: si-LINC00649; 4: si-LINC00649+miR-NC; 5: si-LINC00649+miR-424-5p inhibitor; A: the expression of miR-424-5p was detected by qRT-PCR; B: the results of cell proliferation were detected by CCK-8; C: cell apoptosis was detected by flow cytometry; D, E: ER-related proteins expression were detected by Western blot. *: P < 0.05, compared with si-NC group; #: P < 0.05, compared with si-LINC00649+miR-NC group. 图 5 下调miR-424-5p可部分逆转si-LINC00649介导的增殖、凋亡和氧化应激效应 Figure 5 Downregulation of miR-424-5p could partially reverse the proliferation, apoptosis and oxidative stress effects mediated by si-LINC00649 |
双荧光素酶报告实验结果显示，miR-424-5p mimic可显著抑制WT-IGF1R的荧光活性，而对MUT-IGF1R的荧光活性几乎没有影响（P < 0.05），见图 6A。qRT-PCR检测发现IGF1R在CC组织中表达升高（P < 0.05），与LINC00649的表达呈正相关（P=0.0184），与miR-424-5p负相关（P=0.0282），见图 6B~D。同样的，IGF1R在CC细胞系中的表达较H8细胞系显著升高（P < 0.05），见图 6E。此外，我们还发现，在HeLa细胞中，敲减LINC00649可显著抑制IGF1R的表达，而miR-424-5p inhibitor可显著逆转这一效果（P < 0.05），见图 6F。
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| 1: Control; 2: si-NC; 3: si-LINC00649; 4: si-LINC00649+miR-NC; 5: si-LINC00649+miR-424-5p inhibitor; A: results of dual luciferase reporter assay; B: the expression of IGF1R in CC was detected by qRT-PCR; C: correlation analysis results of IGF1R and LINC00649 in CC tissue; D: correlation analysis results of IGF1R and miR-424-5p in CC tissue; E: the expression of IGF1R in H8 cell lines and CC cell lines (HeLa, MS750, Caski, SiHa) was detected by qRT-PCR. *: P < 0.05, compared with H8 cell line; F: the effects of LINC00649 and miR-424-5p on IGF1R expression in HeLa. ^: P < 0.05, compared with si-NC group. #: P < 0.05, compared with si-LINC00649+miR-NC group. 图 6 IGF1R是miR-424-5p的靶点 Figure 6 IGF1R was the target of miR-424-5p |
qRT-PCR检测显示，IGF1R在si-LINC00649+ pcDNA3.1-NC组的表达水平显著低于si-LINC 00649+pcDNA3.1-IGF1R组（P < 0.05），见图 7A。细胞增殖和凋亡数据显示，敲减LINC00649抑制的细胞增殖活力和促进的细胞凋亡均被上调的IGF1R部分逆转（均P < 0.05），见图 7B~C。Western blot检测结果显示，敲减LINC00649后上调的GRP78、CHOP和Caspase-12被pcDNA3.1-IGF1R部分抑制（均P < 0.05），见图 7D~E。
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| 1: Control; 2: si-NC; 3: si-LINC00649; 4: si-LINC00649+pcDNA3.1-NC; 5: si-LINC00649+pcDNA3.1-IGF1R; A: the expression of IGF1R was detected by qRT-PCR; B: the results of cell proliferation were detected by CCK-8; C: cell apoptosis was detected by flow cytometry; D, E: ER-related proteins expression were detected by Western blot. *: P < 0.05, compared with si-NC group. & : P < 0.05, compared with si-LINC00649+pcDNA3.1-NC group. 图 7 过表达IGF1R可部分逆转si-LINC00649介导的增殖、凋亡和氧化应激效应 Figure 7 Overexpression of IGF1R partially reversed the proliferation, apoptosis and oxidative stress effects mediated by si-LINC00649 |
本研究发现，LINC00649在CC组织和细胞中均异常高表达，且与CC患者的预后不良有关。一系列实验证实了LINC00649/miR-424-5p/IGF1R对CC细胞生物学行为的调控作用。lncRNAs可以参与基因表达调控、剂量补偿、基因组印记、转录激活、转录干扰和核转运、X染色体敲减和染色质修饰等多个重要的生物学过程[8-9]。lncRNA已经成为癌症转录组中重要的组成部分，它通过与蛋白质、DNA和RNA的相互作用在各种癌症的发生和发展中发挥着关键作用[10]。研究表明，LINC00649通过结合miR-15a-5p上调HMGA1的表达，以增强膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭，是膀胱癌潜在的生物标志物和治疗靶点[11]。此外，还发现LINC00649在前列腺癌和结直肠癌中异常高表达[12-13]。本研究采用qRT-PCR检测发现，LINC00649在CC组织和细胞系中较癌旁正常组织和H8细胞显著高表达，且对于CC具有良好的诊断价值。细胞增殖和凋亡实验分析结果显示，敲减CC细胞中LINC00649的水平有助于抑制CC细胞增殖活力，诱导细胞凋亡。此外，内质网是一种经历蛋白质合成、折叠、修饰和调节细胞内Ca2+稳态的细胞器，多种刺激可干扰内质网的稳态，导致未折叠或错误折叠的蛋白质累积和内质网应激（ERs）[14]。Western blot检测ERs相关蛋白的表达结果显示，敲减LINC00649上调了GRP78、CHOP和Caspase-12的表达，提示抑制LINC00649可能通过促进ERs来诱导CC细胞凋亡。
miRNAs可以与mRNAs结合，导致基因敲减，从而影响细胞行为[15]。miR-424-5p可调节肿瘤细胞的各种恶性生物学行为，如miR-424-5p通过调控PTEN/mTOR轴调节乳腺癌细胞的化疗敏感度[16]。miR-424-5p靶向E2F7调控细胞周期，进而抑制肝癌细胞的增殖[17]。肿瘤抑制因子miR-424-5p靶向ACSL4消除卵巢癌的铁死亡[18]。此外，miR-424-5p在CC中发挥抑癌功能也被报道证实[19-20]。本研究发现，miR-424-5p在CC组织和细胞中均为异常低表达，与LINC00649负相关。敲减LINC00649促进的ERs、诱导的CC细胞凋亡和抑制的细胞活力均能被miR-424-5p抑制剂部分逆转，这表示LINC00649可能通过抑制miR-424-5p的表达在CC中发挥促癌作用。
为进一步探究LINC00649和miR-424-5p在CC中的作用机制，我们利用TargetScan、miRWalk和miRDB获取miR-424-5p的下游靶基因并进行功能富集分析，结果筛选得到IGF1R。IGF1R作为一种跨膜受体，由IGF-1和相关生长因子IGF-2激活[21]。配体与受体的结合导致受体寡聚化、蛋白酪氨酸激酶激活、分子间受体自身磷酸化和细胞底物磷酸化，从而导致基因激活、DNA合成和细胞增殖，在包括CC在内的多种人类癌症中发现了IGF1R的过度表达[22]。据报道，IGF1R是CC细胞侵袭和增殖的有效刺激因子，由αvβ3整合素信号调节[23]，且miR-497可靶向IGF1R抑制CC的发生[24]。本研究发现，IGF1R在CC组织和细胞中的表达升高，与LINC00649正相关，与miR-424-5p负相关。敲减LINC00649促进的ERs、诱导的CC细胞凋亡和抑制的细胞活力均能被上调的IGF1R部分逆转，这些结果表示LINC00649可能通过靶向miR-424-5p上调IGF1R的表达在CC中发挥促癌作用。
综上所述，本研究揭示了敲减LINC00649可通过调节miR-424-5p/IGF1R轴促进ERs的发生，进而诱导CC细胞凋亡，为CC的治疗提供了新的理论依据。然而本实验仅对LINC00649在CC中的体外实验进行验证，未来还需要对体内实验及LINC00649可能参与调控的信号通路展开相应的探讨。
作者贡献：
旦慧文：实验实施、文章撰写
张焕敏：数据收集、统计学分析
王婷婷：数据审核、文章校对
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