0 引言

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，是全球女性癌症相关死亡的主要原因^[1]，因此，探索乳腺癌的防治措施至关重要。脂肪酸（fatty acid, FA）合成增强是肿瘤细胞的一个标志性的代谢改变。肿瘤细胞持续分裂增殖需要新合成大量细胞膜，而FA是合成膜磷脂的基本原料砌块，并能为肿瘤细胞提供能量支持，还用于合成一系列促癌脂质信号分子，FA在肿瘤的发生发展过程中起重要作用^[2-3]。硬脂酰辅酶A去饱和酶1（stearoyl-CoA desaturase 1, SCD1）是催化饱和脂肪酸（SFA）转化为单不饱和脂肪酸（MUFA）的关键酶，是FA合成途径中最终步骤的限速酶。近年来，在肺癌、结肠癌、肾癌等多种肿瘤组织中，都发现SCD1表达水平升高^[4-5]。本研究通过检测SCD1在乳腺癌组织中的表达情况，并应用SCD1特异性的小分子抑制剂——MF-438干预乳腺癌细胞，分析抑制SCD1的功能对乳腺癌细胞增殖凋亡的影响，并初步探讨其可能机制，为SCD1作为乳腺癌治疗的新靶标提供依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂

SCD1抑制剂MF-438购自德国Merck Millipore公司；DMSO购自北京Solarbio公司；CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（MTS）试剂盒购自美国Promega公司；Hoechst NO.33342试剂盒购自北京Coolaber公司；Propidium iodide staining（PI）购自美国Sigma公司；SCD1、Bcl-2、Bax小鼠单克隆抗体均购自美国Santa Cruz Biotechnology公司；β-actin小鼠单克隆抗体购自美国Signalway Antibody公司；辣根酶标记山羊抗小鼠IgG抗体购自北京康为世纪生物科技有限公司；SABC免疫组织化学试剂盒、DAB显示剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 乳腺癌细胞和组织来源

人乳腺癌MCF-7细胞株和健康者皮肤成纤维细胞（HSF细胞）为河北省人民医院临床医学研究中心保存。乳腺癌组织由河北省人民医院伦理委员会批准，患者知情同意后，收集2010年1月—2013年12月65例河北省人民医院乳腺癌手术切除的病理标本，另收集37例癌旁正常乳腺组织作对照。所有标本均经常规石蜡包埋切片及组织病理学检查证实。患者术前均未接受过放疗或化疗等新辅助治疗。

1.3 组织微阵列的构建^[6]

应用组织包埋仪向包埋模中注入蜡液，冷却凝固后在蜡模上挖取组织芯槽。根据HE切片选取富含肿瘤细胞的代表性区域，在相应的石蜡包埋乳腺癌组织块表面上标记。用组织芯穿刺针从所选区域取出直径1.8 mm的组织芯样品。将组织芯柱依次放入组织芯槽中，向芯槽中注入蜡液填满未布组织芯的区域，冷却凝固既得组织芯阵列石蜡包埋块。4 μm厚连续切片，裱片、烤片、冷却后保存于4℃冰箱中。

1.4 免疫组织化学染色

采用免疫组织化学SP法染色，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。SCD1抗体的稀释比例为1:100，DAB显色，苏木精对比染色。以PBS代替一抗作为阴性对照，以SCD1已知阳性的切片作为阳性对照。

结果判定：SCD1表达阳性细胞的标准是细胞质内染成棕色颗粒，阳性细胞数0~5%为（-），阳性细胞数 > 5%~25%为（+），阳性细胞数 > 25%~50%为（++），阳性细胞数 > 50%为（+++）。将（-）定为表达阴性，将（+~+++）例数相加作为阳性例数。

1.5 MTS法检测SCD1抑制剂对细胞增殖的影响

将MCF-7细胞接种于96孔板，8 000个或1×10⁴个/孔，分别用含10%或2%FBS的RPMI1640培养基培养24 h，用不同浓度MF-438或对照DMSO干预细胞48 h，使用MTS法，加入20微升/孔CellTiter 96^® AQueous One Solution Reagent，在37℃、5%CO₂的培养箱中孵育1 h，使用酶标仪检测490 nm的吸光度值测定细胞活性，并计算IC₅₀值。

1.6 细胞凋亡分析

1.6.1 Hoechst33342染色荧光显微镜观察细胞形态

应用2%FBS的RPMI1640培养基培养MCF-7细胞24 h，加入5 μmol/L MF-438或对照DMSO作用48 h，弃培养基，加入荧光染料Hoechst33342，37℃避光染色20 min。荧光显微镜观察并摄像，细胞核呈浓缩或碎片状的细胞为凋亡细胞。在荧光显微镜下随机选取5个视野观察细胞凋亡情况，根据公式计算凋亡指数。凋亡指数=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

1.6.2 细胞凋亡率检测

应用2%FBS的RPMI1640培养MCF-7细胞24 h，加入5 μmol/L MF-438或对照DMSO作用48 h后，0.25%胰酶消化贴壁细胞，与悬浮细胞一起收集，细胞数目约（1~5）×10⁶个每毫升，离心弃PBS，加入4℃预冷的70%的乙醇固定1~2 h，离心弃固定液，PBS重悬，400目筛网过滤，离心弃PBS，加入1 ml PI染液（100 μg/ml），4℃避光染色30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，亚G₀/G₁峰为凋亡细胞峰，进行细胞凋亡率分析。

1.7 蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达

MCF-7细胞经5 μmol/L MF-438或对照DMSO作用48 h，用细胞裂解液提取总蛋白，进行SDS-PAGE电泳分离蛋白，并将凝胶上的目的蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉的TBST液封闭PVDF膜2 h，分别加入一抗Bcl-2、Bax和β-actin 4℃摇床孵育过夜，加入二抗，室温反应2 h；将发光液均匀地滴在PVDF膜的蛋白面上，出现明显荧光条带后，依次压片、曝光、显影和定影。将X线胶片于凝胶成像系统照像，Image J v1.8软件进行分析。结果用目的蛋白条带的IOD值与β-actin条带的IOD值的比值表示。

1.8 统计学方法

所有数据均应用SPSS 19.0软件进行分析，数据结果以（x±s）表示，应用χ²检验和单因素方差分析进行组间比较，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 SCD1在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达

免疫组织化学检测结果显示，SCD1表现出弥漫性胞质染色，SCD1在绝大多数乳腺癌组织标本中为中-高度表达，而在癌周正常乳腺组织中表达较低或不表达，见图 1。SCD1在乳腺癌组织中阳性表达率（72.30%, 47/65）显著高于正常乳腺组织（18.92%, 7/37），差异有统计学意义（χ²=26.976, P=0.000）。SCD1在不同分子亚型的乳腺癌中的表达差异有统计学意义（P=0.031），激素受体阳性（HR+）或HER2+乳腺癌的SCD1表达水平高于三阴性（triple negative, TN）乳腺癌。SCD1的表达与患者年龄、月经状态、肿瘤临床分期和组织分级均无相关性（P > 0.05），见表 1。

2.2 SCD1抑制剂对乳腺癌MCF-7细胞和正常HSF细胞的增殖抑制作用

MTS法检测MF-438作用的剂量-效应曲线结果显示，不论是在10%还是2%FBS条件下，与DMSO对照组相比，MF-438在0.1~100 μmol/L浓度范围内作用48 h后，均对MCF-7细胞显示出显著的剂量依赖性增殖抑制作用，即MCF-7细胞增殖活性随MF-438浓度增加而降低，并呈一定的剂量依赖性，见图 2。2%FBS培养时，MF-438在除100 μmol/L以外各浓度作用下的细胞存活率均较10%FBS组降低（P < 0.05）。在10%FBS条件下，MF-438作用的IC₅₀值测定为（18.6±0.35）μmol/L，在2%FBS条件下，IC₅₀为（3.9±0.45）μmol/L。而单纯降低血清浓度（2%FBS）培养时，MCF-7细胞的增殖活性仅有轻微下降。这表明，在低血清浓度中生长的MCF-7细胞对SCD1抑制剂的生长抑制作用更为敏感。在10%FBS条件下，MF-438并未对正常HSF细胞产生明显的生长抑制作用，见图 3。

2.3 SCD1抑制剂诱导MCF-7细胞凋亡

2.3.1 SCD1抑制剂作用于MCF-7细胞的形态学改变

荧光显微镜下DMSO干预的对照组MCF-7细胞的核质密度均匀一致，呈弥散均匀的蓝色荧光。而5 μmol/L MF-438作用48 h后，表现出典型的细胞凋亡特征性变化。凋亡细胞荧光增强，与周围细胞脱离接触，细胞全面皱缩变小；胞膜向内皱缩，胞质浓缩；胞核固缩并碎裂，呈大小不等的形似块状、圆形或花瓣状的细胞碎片，凋亡小体形成，也可见染色质浓缩边缘化，而呈新月形蓝色荧光，见图 3。与对照组（5.2±0.05）比较，MCF-7细胞经5 μmol/L MF-438作用后（23.7±0.10），凋亡指数均显著升高（F=13.497, P=0.006）。

2.3.2 SCD1抑制剂作用于MCF-7细胞凋亡率分析

5 μmol/L MF-438作用48 h后，MCF-7细胞的凋亡率明显增高（MF-438（4.78±0.22）% vs.对照（0.54±0.12）%, F=828.007, P=0.000），差异有统计学意义。结果表明，SCD1抑制剂促进肿瘤细胞凋亡，见图 4。

2.4 SCD-1抑制剂对细胞凋亡相关蛋白表达的影响

5 μmol/L SCD1抑制剂MF-438作用MCF-7细胞48 h后，与DMSO对照组相比，抑凋亡蛋白Bcl-2的表达水平显著低于对照组，降低约28%，差异有统计学意义（F=24.247, P=0.008）；而促凋亡蛋白Bax的表达水平显著高于对照组，增加约36%，差异有统计学意义（F=25.012, P=0.007），见图 5。

3 讨论

流行病学研究表明，肥胖与乳腺癌的发生发展密切相关，不仅是乳腺癌的危险因素，还与不良预后相关^[7-8]。乳腺癌的发生发展还与机体脂代谢密切相关。新细胞膜的形成是细胞生长和增殖的必要条件，脂质双分子层是构成细胞膜的基本支架。MUFA是生物膜结构的主要成分，通过酰化作用生成以磷脂质为主的膜脂质，MUFA在肿瘤细胞的膜结构和功能中发挥着重要作用。SCD1是Δ9脂肪酸去饱和酶，是催化SFA转化为MUFA的关键酶^[9]。近年来研究显示，在脂肪肝、糖尿病、肥胖和某些肿瘤患者中均发现SCD1表达水平异常升高，SCD1与脂代谢紊乱有着密切的联系，可能是多种疾病发生发展的枢纽^{[2, 5, 10]}。本研究结果也显示，SCD1在乳腺癌组织中高表达，而在正常乳腺组织中低表达或不表达，差异有统计学意义。本研究中，我们还发现SCD1在HR+和HER2+乳腺癌亚型中的表达高于TN乳腺癌。然而有报道显示雌激素负调节SCD1的表达^[11]，这似乎与本研究结果矛盾。因本研究样本量较少，需要扩大样本量进一步研究证实不同乳腺癌亚型中SCD1表达的差异。

本研究结果显示，MF-438对MCF-7细胞显示出显著的剂量依赖性的增殖抑制作用，并且在低血清浓度培养条件下的MCF-7细胞对SCD1抑制剂的生长抑制作用更为敏感，然而SCD1抑制未对正常HSF细胞产生明显的生长抑制作用。此外，在结肠癌和肺癌的体外实验中也观察到了抑制SCD1能产生抗肿瘤作用^{[5, 10]}。

在肿瘤的发生发展过程中，除了细胞的异常增殖，更重要的是细胞凋亡能力的降低。本研究进一步从细胞凋亡方面分析SCD1抑制剂对MCF-7细胞增殖的抑制作用。结果显示，在SCD1抑制剂的作用下，MCF-7细胞表现出了典型的细胞凋亡特征性改变，并且MF-438干预组凋亡指数及凋亡率明显高于对照组（P < 0.05）。

Bcl-2和Bax分别是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促进凋亡蛋白，两者在肿瘤细胞凋亡信号通路中发挥重要的调控作用^[12-17]。因此，本研究进一步检测了Bcl-2和Bax的表达情况，结果显示，抑制乳腺癌MCF-7细胞的SCD1活性能显著降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，同时明显增加促凋亡蛋白Bax的表达水平，这可能是SCD1抑制剂诱导MCF-7细胞凋亡的分子机制之一。

总之，本研究证实了SCD1在乳腺癌组织中高表达。抑制SCD1的活性能显著抑制乳腺癌MCF-7细胞增殖并诱导细胞凋亡。SCD1抑制剂可能通过降低抑凋亡蛋白Bcl-2的表达并增加促凋亡蛋白Bax的表达，实现其抑制肿瘤细胞增殖促进凋亡的作用。上述结果提示SCD1在乳腺癌的发生发展中发挥着重要作用，对SCD1的深入研究将有望为乳腺癌的分子靶向治疗提供一个新的靶标。