2017, Vol. 44文章信息
- 金丝桃苷诱导人胃癌细胞MKN-45凋亡及其机制
- Hyperoside Induces Apoptosis of Gastric Cancer Cell Line MKN-45 and Related Mechanism
- 肿瘤防治研究, 2017, 44(12): 792-795
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(12): 792-795
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2017.17.0461
- 收稿日期: 2017-04-27
- 修回日期: 2017-08-09
引用本文 |
2. 121000 锦州，锦州医科大学附属第一医院消化内科
2. Department of Gastroenterology, First Affiliated Hospital of Jinzhou Medical University, Jinzhou 121000, China
胃癌是一种发病率和病死率均较高的恶性肿瘤，最近一项研究显示，在已确诊的950 000例胃癌的新病例中，每年有超过720 000人死亡[1]。胃癌的治疗方式主要为手术切除及术后化疗，但患者术后复发率和转移率较高，化疗药物存在很多不良反应，因此，新的抗癌药物的研发一直是发展趋势。
金丝桃苷（hyperoside, Hyp）属黄酮类化合物, 又名槲皮素3-O-β-半乳糖苷，是贯叶金丝桃的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗血栓等多种生理活性[2]。近年来国内外研究发现金丝桃苷具有抗结肠癌、肺癌、胰腺癌等肿瘤细胞的作用，其机制是通过抑制凋亡通路来实现的[3]，但对Hyp抗胃癌细胞的研究较少。本实验旨在探讨Hyp对胃癌MKN-45细胞株在体外增殖、凋亡的影响及其机制，进一步探讨Hyp的抗肿瘤作用。
1 材料与方法 1.1 实验材料人MKN-45胃癌细胞株（上海生科院细胞资源中心）、DMEM培养液、胎牛血清（美国Gibco公司）、Hyp（南京春秋生物科技公司）、MTT（美国Sigma公司）、Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡试剂盒（美国BD公司）、NF-κB P65、caspase-3、Bax、Bcl-2抗体（英国Abcam公司）。
1.2 细胞培养将MKN-45胃癌细胞株置于含10%胎牛血清、100 µg/ml青霉素/链霉素双抗溶液和10 µg/ml环丙沙星的高糖DMEM培养液中，于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，胰蛋白酶消化，每2~3天传代一次并观察细胞的变化。
1.3 MTT法检测Hyp对MKN-45细胞增殖的影响取对数生长期的MKN-45细胞悬液200 µl，分别以每孔1×104接种于96孔板中，细胞培养24 h后加入药物。实验分组：Hyp（12.5、25、50、100、200 µg/ml）作用于MKN-45细胞，对照组为不加药物。每个剂量设5个复孔，加药后分别培养24和48 h，随后每孔加入MTT 20 µl，放入培养箱继续培养4 h，吸弃培养液，每孔加150 µl二甲基亚砜（DMSO），避光振荡10 min，以使结晶物充分融解，用酶标仪（490 nm）测定各孔的吸光度OD值，计算每组细胞的增殖率，并绘制折线图 1。
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| *: P < 0.05, #: P < 0.01, compared with the same concentration of hyperoside; b: P < 0.01, compared with control group 图 1 不同浓度Hyp作用不同时间后对MKN-45细胞增殖率的影响 Figure 1 Proliferation of gastric cancer cells MKN-45 treated with hyperoside at various concentrations for 24 and 48h |
分别收集对照组及经25、50、100 µg/ml Hyp处理48 h后的MKN-45细胞，预冷PBS洗涤细胞2次，70%冷乙醇固定过夜。取1 ml各组细胞悬液（调整其细胞浓度为5×105/ml），分别加50 mg/ml RNaseA和PI染液，37℃温育30 min，然后上流式细胞仪进行周期分析。
1.5 流式细胞术检测Hyp对MKN-45细胞凋亡的影响采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞的凋亡率，分别收集对照组和经25、50、100 µg/ml Hyp作用48 h的MKN-45细胞，调整细胞密度，按说明处理细胞：PBS洗细胞2次；收集5×105个细胞，加入500 µl Bingding Buffer重悬细胞；分别加入5 µl Annexin V-FITC和PI室温避光染色15 min，流式细胞仪检测，分析凋亡率。
1.6 Western blot法检测NF-κB P65、caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白水平以浓度为25、50、100 µg/ml的Hyp分别处理细胞48 h，胰酶消化后收集细胞（＞5×106/ml），置于冰上；RIPA溶液裂解蛋白，BCA蛋白定量，转膜，TBST洗膜，5%脱脂牛奶封闭1 h后加一抗4℃孵育过夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入二抗，摇床摇动2 h，显影及定影，使用Image-J软件，定量分析扫描图片中的电泳条带灰度值。
1.7 统计学方法采用SPSS 19.0软件进行单因素方差分析，实验结果以（x±s）表示，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 不同浓度Hyp作用后对胃癌细胞MKN-45增殖的影响作用相同时间，随着药物浓度的增加，Hyp对MKN-45细胞生长的抑制力增强。低浓度Hyp（12.5 µg/ml）作用细胞24和48 h后，与对照组相比，差异无统计学意义（P=0.178、P=0.135），25、50、100、200 µg/ml Hyp分别作用细胞24和48 h后，与对照组相比，各组间相比差异均有统计学意义（P=0.000），见图 1。
2.2 不同浓度Hyp对细胞周期的影响不同浓度的Hyp作用于胃癌MKN-45细胞48 h后，随着药物浓度的增加，G0/G1期比率明显增加，S和G2/M期明显减少，与对照组相比，差异有统计学意义，见图 2。
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| *: P < 0.05, compared with control group; #: P < 0.01, compared with control group; n=5 图 2 48 h后不同浓度Hyp对MKN-45细胞周期分布的影响 Figure 2 Cell cycle of gastric cancer cells MKN-45 treated with hyperoside at various concentrations after 48h in vitro |
不同浓度的Hyp作用MKN-45细胞48 h后，其凋亡率随着药物浓度的增加而增加。100 µg/ml Hyp作用48 h后，细胞凋亡率由对照组的（4.63±0.65）%升高至（35.23±0.58）%，差异有统计学意义（P=0.000）。由此可见，Hyp可诱导MKN-45细胞的凋亡，并且呈剂量依赖性，见图 3。
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| A: control group; B: Hyp (25μg/ml) group; C: Hyp (50μg/ml) group; D: Hyp (100μg/ml) group 图 3 48 h后不同浓度Hyp组对细胞凋亡率的影响 Figure 3 Apoptosis of gastric cancer cells MKN-45 treated with hyperoside at various concentrations after 48h in vitro |
用25 µg/ml Hyp处理MKN-45细胞48 h后，通过Western blot法检测相关蛋白表达。Caspase-3（P=0.000）、Bax（P=0.006）表达明显上升，NF-κB P65（P=0.026）、Bcl-2（P=0.013）表达量降低，随着药物浓度的增加差异越显著，见图 4。
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| 1: control group; 2: Hyp (25μg/ml) group; 3: Hyp (50μg/ml) group; 4: Hyp (100μg/ml) group 图 4 48 h后不同浓度Hyp对NF-κB P65、casepase-3、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 Figure 4 Expressions of NF-κB P65, casepase-3, Bax and Bcl-2 protein treated with hyperoside at various concentrations after 48h |
在我国，胃癌的发病率日益增长，现有抗癌药物存在不良反应大及耐药性等问题，新药的研发一直是热点，而我国传统中药的抗癌研究已成为重点之一[4]。近年来，有研究表明黄酮类中药金丝桃苷在抗肿瘤方面有较好疗效，但因研究较少，对于一些肿瘤并未涉及且治疗机制仍需进一步研究。
目前，探讨肿瘤细胞凋亡是药物研究的趋势，细胞凋亡不同于细胞坏死，是一种基因调控下细胞自主的有序死亡过程，在维持内环境中发挥了重要作用。细胞凋亡的失调与肿瘤的发生、发展及退化密切相关。诱导细胞凋亡，已成为阻止癌细胞生长和发展的有效途径之一[5]。阻滞细胞周期是抑制肿瘤生长的重要原因之一，细胞周期的正常运转受到多个调控点的作用，若药物可作用于某调控点，阻滞细胞周期，可使细胞终止分裂。孙时华等[6]研究发现，胃癌细胞BGC-823经一定浓度金丝桃苷作用后，细胞在G0/G1期被阻滞，从而抑制细胞增殖，细胞凋亡率也由对照组的3.66%增至53.48%；Zhang等[7]研究显示，经一定浓度金丝桃苷处理后的骨肉瘤细胞，增殖率下降，并在G0/G1期出现停滞，且发生明显的凋亡现象。本研究发现，不同浓度金丝桃苷处理胃癌MKN-45细胞后，随着药物浓度的增加，G0/G1期细胞百分率不断增加，使癌细胞停滞于G0/G1期，从而达到抗肿瘤的目的。
Bcl-2家族是迄今为止研究最多的凋亡基因组之一，它在滤泡性淋巴瘤的癌基因中首次被提出，并已被证明可抑制细胞凋亡[8]。Bcl-2家族蛋白分为抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL和促凋亡蛋白Bax、Bak。Bcl-2基因是细胞凋亡的重要负调控因子，一方面它通过抑制细胞凋亡延长肿瘤细胞存活时间，另一方面，Bax可加速死亡信号传递。尽管Bcl-2家族如何精确地调控细胞凋亡尚不明确，但大量研究表明，Bcl-2可通过调节ER和线粒体之间Ca2+的平衡，抑制Cyt-c从线粒体释放，从而抑制细胞凋亡[9]。Bcl-2家族蛋白的表达已在人类多种恶性肿瘤中被报道，有研究显示Bcl-2家族蛋白的表达可预测胃癌患者的预后[10]；近期Boukes等[11]发现，在体内外实验中，金丝桃苷均可以通过抑制Bcl-2家族基因来抑制胰腺癌的增殖并促进其凋亡，本研究结果显示，胃癌细胞MKN-45经一定浓度金丝桃苷处理后，Bcl-2家族蛋白的表达发生变化，促凋亡蛋白Bax表达增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低，最终诱导其凋亡，验证了金丝桃苷的抗肿瘤作用。
核因子κB（NF-κB）是一种具有多种功能的转录因子，对多种肿瘤的发展至关重要。NF-κB参与癌细胞转化的很多过程，在诱发基因抗凋亡、血管生成、癌细胞的转移和扩散中均扮演着重要的作用[12]。通过磷酸化触发IκB的降解，使游离的NF-κB进入细胞核暴露其核识别位点，从而促进NF-κB调控基因的转录，减少相关蛋白的表达。凋亡过程受到多个通路和基因调控，最后多条通路可共同激活caspase-3，因此，caspase-3的检测是提供细胞凋亡的有利证据。caspase-3作为蛋白酶级联过程中的中心节点，NF-κB也能直接抑制caspase-3的活化，从而抑制caspase-3下游一系列的反应，最终抑制肿瘤细胞凋亡[13]。目前，大量文献已阐明，阻断NF-κB通路可抑制胃癌细胞的增殖并诱导其凋亡，如姜黄素[14]、槲皮素[15]和厚朴酚[16]等抑制相关癌细胞的凋亡均可通过抑制NF-κB信号通路来实现。近几年，Liu等[17]研究显示，金丝桃苷可通过抑制NF-κB通路，上调caspase-3促进肺腺癌细胞A的凋亡。Li等[18]发现，金丝桃苷通过抑制NF-κB通路，抑制胰腺癌细胞PANC-1和BxPC-3的增殖，并促进其凋亡。多年前，王维等[19]研究表明，胃癌患者中NF-κB P65蛋白的表达明显高于健康者，随着胃癌恶性程度的增加，P65蛋白的表达明显增加，因此P65蛋白的分析在胃癌的研究中有重要意义。本研究的细胞凋亡结果显示，金丝桃苷可能通过阻断NF-κB通路，抑制NF-κB P65蛋白的表达，上调caspase-3，促进细胞凋亡有关，但具体阻断NF-κB信号通路的方式还需进一步研究。
综上所述，体外培养MKN-45胃癌细胞株接受金丝桃苷这种来自黄酮类化合物的传统中药治疗，肿瘤细胞被抑制并促进其凋亡，机制可能与其抑制NF-κB通路及调控Bcl-2家族蛋白表达，下调NF-κB P65及Bcl-2蛋白，上调casepase-3及Bax蛋白有关。此研究说明金丝桃苷可能成为前景很好的预防及治疗胃癌的药物，未来的研究应该确定金丝桃在体内诱导分化胃癌细胞的活性，这还需进行进一步动物实验及临床研究来验证，本研究仍存在不足，具体抗肿瘤机制需不断探索，为临床应用提供新的治疗方案。
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