0 引言

卵巢癌是女性生殖系统第二大常见肿瘤，病死率居于妇科肿瘤首位，其中卵巢上皮性癌（epithelial ovarian carcinoma, EOC）占卵巢恶性肿瘤的90%，由于卵巢深藏于盆腔且发病早期无明显临床症状，患者就诊时往往已是晚期，5年生存率低于15%，若在早期诊治生存率可高达90%^[1]，因此，提高临床早期诊断水平意义重大。目前临床主要通过妇科盆腔检查、内腔镜检查，血清CA125、HE4等标志物检测，联合应用影像学检查诊断卵巢癌，敏感度较低，存在局限。近年来，筛查技术发生了巨大革新，各种新型肿瘤标志物被相继发现并应用于临床。“液体活检”、“液态芯片”等技术因其无创、精准的特性，有望成为未来妇科肿瘤筛查发展的方向。本文对近年来与卵巢癌诊断相关的新型肿瘤标志物及其研究进展作一综述。

1 液体活检（liquid biopsy）

通过从血液等非实性生物组织中检测、分析其中的游离肿瘤DNA片段，从而进行早期筛查、建立基因表达谱，提供更全面的肿瘤DNA信息，可对肿瘤进展实时监测，是精准医疗的重要途径之一^[2]。卵巢癌发生、发展过程中存在多种基因突变和表观遗传改变，通过检测特异改变有助于了解肿瘤的发病机制，并可作为特异性分子标记应用于早期诊断、病情评估和预后预测^[3]。

1.1 循环肿瘤细胞（circulating tumor cells, CTCs）

因侵袭、脱落、手术等导致进入血液循环的肿瘤细胞，早期检测血中CTCs可以早期诊断EOC^[4]。Pearl等^[5]检测129例EOC患者术前侵略性CTCs（iCTCs）敏感度为41.2%，特异性为95.1%，阳性预测率为77.8%，优于单一CA125筛查。

CTCs的分离和富集是一种极具前景的恶性肿瘤监测手段^[6]，目前分离富集方法包括Nano Velcro cell-affinity substrates CTC芯片技术、核酸适配体（aptamer）技术、微流控芯片技术（microfluidics chip technology），以及近期研发的分层纳米线芯片^[7]等。基于免疫吸附的Cell Search技术，是唯一获得美国食品药品管理局（FDA）批准应用于临床CTCs检测的技术，此方法主要依赖于CTCs上表达的上皮细胞黏附分子（EpCAM），受肿瘤异质性和CTCs上皮间质转化影响较大，同时受抽血量的限制，很难获得大量CTCs。如何快速、准确、高效地分离和富集循环血液中少量的肿瘤细胞是研究中的难题，而如何保持分离后细胞的完整性和活性将是今后CTCs分离富集技术的研究重点。

1.2 循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA, ct DNA）

CTCs脱离肿瘤组织入血后来源于肿瘤细胞的DNA即ctDNA，ctDNA携带多种与肿瘤相关的分子特征，如单核苷酸突变、甲基化改变、杂合子缺失等，通过早期检测ctDNA水平可以实现对肿瘤的早期诊断^[8]。Zhang等^[9]采集202例卵巢癌患者术前血清样本，对APC、RASSF1A、CDH1、RUNX3、TFPI2、SFRP5和OPCML基因进行联合检测，敏感度、特异性分别为85.3%和90.5%，显著优于单一检测，多种基因联合筛查可以提高诊断效力。甲基化状态异常也被认为是癌症发生的原因之一，EOC细胞基因如BRCA1、MLH1、HOXA9等存在异常甲基化，ctDNA甲基化检测技术具有筛查早期卵巢癌的巨大潜能。

目前检测识别ctDNA突变基因技术包括实时荧光定量PCR（RT-PCR）、数字PCR（dPCR）、微滴式数字PCR（ddPCR）、BEAMing技术（Bead、Emulsion、Amplification、Magnetic），以及二代基因测序（NGS）等。RT-PCR技术运用较多，但敏感度低；BEAMing技术实现了单分子DNA绝对定量，但操作复杂，应用并不广泛；基于NGS的方法仅能为50%的早期患者提供有价值的诊断，尚需进一步改善；dPCR检测ctDNA的敏感度和特异性较高，在卵巢癌检测中应用较多^[10]，但由于该技术操作流程繁杂，限制了推广。此外，这些技术的成本均相对较高，制约了其临床应用。近期Cohen等^[11]对32名高级别浆液性卵巢癌患者进行无创DNA检测，以染色体拷贝数变化≥15 Mb为检测阳性标准，敏感度为40%，特异性为94%，通过染色体拷贝数变化可能检测出早期卵巢癌。随着三代测序技术的出现，ctDNA的检测不再受限于DNA聚合酶的扩增，ctDNA终将会在临床实践中得到广泛应用。

1.3 肿瘤细胞来源的外泌体（tumor cell-drived exosomes, TEXs）

TEXs是由细胞膜内陷后形成的多囊泡小体，广泛分布于外周血、唾液等体液中，影响信号转导通路，参与肿瘤微环境的调控，为肿瘤的诊断提供了新的思路^[12]。Liang等^[13]从两种卵巢癌细胞株培养上清液中分离得到外泌体，通过基因功能分析发现与肿瘤发生、转移相关的蛋白，可能成为EOC新的诊断标志物。另外，外泌体携带的分子如miR-105在肿瘤发生转移前即可在循环中检测到，表达水平与肿瘤转移相关，可用于早期评估肿瘤转移^[14]。随着对外泌体研究的深入，将为肿瘤的早期诊断、疾病监测等带来更多的价值。

1.4 液态芯片（liquid chip）

液态芯片是基于流式细胞仪发展的新技术，以标记的微球为反应界面，在不同的微球上固定不同的探针分子，通过两束激光分别检测荧光信号和微球编码，实现对同一样品中多个不同分子同时检测^[15]。液态芯片采用高通量荧光微球策略，将血清抗原、抗体等多种标志物联合用于EOC的早诊，目前有研究^[16]利用液态悬浮芯片技术构建卵巢恶性肿瘤诊断模型，诊断敏感度（90.6%）、特异性（93.6%）优于单一CA125检测。液态芯片因其出众的高通量、高敏感度、线性范围广等检测性能，契合了临床肿瘤标志物应用的需求，适用于批量标本多指标检测，已被应用于临床诊断领域^[17]，代表了临床肿瘤标志物检测的应用趋势，可以预见液芯技术将引领肿瘤标志物检测进入真正的联检时代。

2 多指标联合诊断

肿瘤是一个多因素、多阶段、多基因变异的复杂病变过程。单一标志物敏感度、特异性往往难以满足疾病诊断要求，多种肿瘤标志物联合检测利用不同标志物之间的互补性，弥补了这一局限，可以提高诊断敏感度。

CA125是EOC诊断的主要肿瘤标志物，近期研究表明^[18]，CA125具有复杂的糖基化修饰形式，利用它在良恶性疾病间的差异，有望找到更有应用价值的CA125亚型，从而提高诊断特异性，但尚有20%~30%的EOC不表达，并受月经期、盆腔炎症、妇科良性肿瘤等影响，因此需要寻找更优良的早期诊断标志物。人附睾蛋白4（HE4）作为新型肿瘤标志物在诊断卵巢癌和预测疗效方面均优于传统标志物CA125，目前HE4已作为EOC的诊断辅助指标应用于临床，然而血清HE4水平亦受年龄、绝经状态、妊娠情况等多种因素影响。血清HE4与CA125联合鉴别卵巢良恶性肿瘤具有较高的诊断能力，对卵巢癌Ⅰ、Ⅱ期的检测更具有诊断价值，是对CA125的有效补充^[19]。

TM4SF1（TAL6，L6）蛋白，是四次跨膜蛋白L6超家族成员之一，与恶性肿瘤的血管形成密切相关，可促进多种肿瘤的侵袭与转移^[20]。刘慧敏等^[21]发现TM4SF1蛋白在EOC癌组织中阳性表达率高于卵巢良性肿瘤组织及正常卵巢上皮组织，随着卵巢上皮细胞的异常增生、恶性转变及临床期别的升高其表达升高。TM4SF1蛋白与EOC的发生、发展有着密切关联，但其机制有待更深入的研究；C1D基因编码一个保守的DNA绑定蛋白可诱导细胞凋亡。C1D能够在EOC患者血清中产生自身抗体，可能是由于EOC细胞中C1D的异位表达刺激了机体免疫系统所致。C1D在EOC的发生、发展中的作用尚需进一步研究；FXR1基因是脆性X智力迟钝相关基因家族中的一员，可调控其靶mRNA翻译，并参与micRNA的调控途径。在EOC患者血清中可检测到抗FXR1抗原自身抗体，其作用机制有待更深入的研究^[22]；TIZ（TRAF6-inhibitory zinc finger protein）是TRAF6的细胞内绑定分子，可通过阻断NF-κB、JNK、p38、ERK1/2、C-FOS等蛋白参与的下游信号转导，影响EOC等恶性肿瘤的发生、发展。TIZ蛋白在EOC患者血清中的表达率较卵巢良性疾病和正常卵巢高，可能作为EOC诊断的肿瘤标志物^[23]。有研究^[24]联合卵巢癌相关抗原TM4SFl、C1D、FXR1 IgG型自身抗体及TM4SFl、TIZ抗原IgM型自身抗体组成自身抗体谱诊断早期卵巢癌，单独检测敏感度（76.6%）高于CA125（51.1%），与CA125联合检测敏感度、特异性显著高于单独检测抗体谱或CA125。

多项标志物联合检测有可能提高这些标志物临床应用价值，但联合指标越多，检测的简便性、重复性相应变差，检测成本增加，并可能出现假阳性现象，需要结合患者临床症状、影像学检查等综合判断。

3 micRNA、lncRNA和circRNA 3.1 micRNA

micRNA是在人体内广泛分布的内源性非编码RNA，在转录后水平调控基因的表达，许多micRNA分子位于与肿瘤密切相关的染色体变异区^[25]，其检测性、稳定性以及肿瘤组织特异性使得外周血循环micRNA可能作为敏感的临床诊断标志物。郭凤军等^[26]检测50例EOC患者血清中miR-92表达发现其表达量显著增高，表达水平随EOC临床分期进展呈上升趋势，有望成为EOC早期筛查的肿瘤标志物。Shi等^[27]发现miR-200a、miR-200b、miR-200c在EOC患者血清中明显升高，多个micRNA因子的联合应用可以提高诊断敏感度和特异性^[28]，有望成为新的EOC诊断因子。

越来越多的研究表明，micRNA在EOC中发挥癌基因或抑癌基因的作用，影响EOC的发生、发展^[29]，而DNA的甲基化可能是其调控机制之一。miRNA的DNA甲基化在EOC中的研究正逐步开展，且甲基化具有可逆性，靶向去甲基化可使miRNA靶基因表达改变，预示其可成为EOC治疗的新方向，为个体化治疗提供新思路。

3.2 长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）

lncRNA是一类定位于细胞核（质）中，长度大于200 nt的非编码RNA，通过DNA甲基化、印迹基因等多种机制影响编码基因的表达水平，部分lncRNAs可进入外周血和体液，预示其在无创检测中的应用前景^[30]。目前发现越来越多的lncRNAs与妇科肿瘤的发生、发展密切相关，包括HOTAIR、MEG3、HOST2等^[31]。

3.2.1 HOX转录反义RNA

（HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）是首个被发现以反义转录方式调控基因表达的lncRNA。Yiwei等^[32]研究发现，HOTAIR在EOC细胞SKOV3中表达上升，沉默HOTAIR后SKOV3细胞的增殖、侵袭及迁移能力明显下降，提示HOTAIR可能通过调控细胞周期阻滞和细胞凋亡促进EOC细胞的增殖、侵袭及迁移，同时HOTAIR被发现在EOC组织中表达增加，与肿瘤进展及预后明显负相关^[33]。随着基因芯片技术的发展，其功能及分子机制不断被完善，有望成为新的预测妇科恶性肿瘤发生及预后的分子标志。

3.2.2 lncRNA母系表达因子3

（MEG3）可通过调节p53^[34]和血管内皮生长因子^[35]达到抑制肿瘤的目的，在多数EOC中MEG3表达缺失或减少，指导疾病预后。EOC组织中存在高水平的MEG3基因启动子区甲基化，异常甲基化可能导致EOC发生、发展。Sheng等^[36]通过甲基化特异性PCR（MSP）分析20例EOC与正常卵巢上皮组织，发现MEG3在EOC组织呈低表达，并且MEG3启动子区域CpG岛的甲基化可能是导致其低表达的主要原因，相关研究将进一步深入。

3.2.3 人类卵巢癌特异性转录子2（human ovarian cancer-specific transcripts, HOST2）

HOST2很少表达于正常组织或者非卵巢癌组织，但其在EOC中表达上调。刘静等^[37]发现HOST2在EOC和交界性上皮瘤组织的表达明显高于卵巢正常组织，提示HOST2对早期发现卵巢恶性病变趋势有意义，联合CA125、HE4等有望更加特异、早期诊断卵巢恶性肿瘤。Gao等^[38]研究表明高级别浆液性卵巢癌中呈高表达的HOST2可促进卵巢癌细胞的增殖、迁移和侵袭，HOST2可作为miRNA海绵，与let-7b结合并抑制其功能，维持部分癌基因的活性，从而促进肿瘤生长，该研究虽未能深入探讨HOST2在EOC中的机制，但对卵巢癌的研究开辟了新的视角。对HOST2机制的进一步研究将可能增加其在卵巢恶性肿瘤的预防及治疗方面的价值。

3.3 环状RNA（circRNA）

circRNA主要由一个以上外显子构成，无5’、3’末端和poly A尾，形成共价闭合的连续环，通过调控Wnt信号通路、上皮-间质转化等影响肿瘤的发生发展、侵袭、转移等^[39]，circRNAs与卵巢癌、结肠癌、肝癌等肿瘤密切相关^[40]。肿瘤患者和健康者血清外泌体中含量显著不同，在肿瘤组织、血浆等表达具有特异性^[41]，预示circRNAs有望成为肿瘤早期诊断的分子标志物。大部分circRNAs通过调控miRNA间接实现其功能，在卵巢癌中circRNAs通过调控miR-138阻止增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen, PCNA）和B细胞淋巴瘤-2通路抑制癌细胞的生长，抑制miR-138时，LIM激酶1（Limk1）/cofilin信号通路被激活，将导致卵巢癌细胞的转移^[42]。

目前，关于circRNAs表达及功能的研究虽然尚处于起步阶段，应用于检测circRNAs表达的技术包括实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、基因芯片分析（gene chip analysis）、RNA印迹（Northern blot）、荧光原位杂交技术（FISH）及生物素偶联circRNA捕获（biotin-coupled circRNA capture）等^[43]。除检测circRNAs自身的表达外，使用这些表达分析技术同时检测circRNAs与相关miRNA的表达量，深入研究circRNAs的miRNA分子“海绵”作用，也是研究需要关注的热点。

4 展望

肿瘤血清标志物的存在或量变可以提示肿瘤的性质，从而了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，帮助肿瘤的诊断、分类、预后评估以及指导治疗。从广为人知的蛋白类肿瘤标志物，再到近几年兴起的CTCs、ctDNA、micRNAs等，随着科学技术的不断进步，特别近年来二代测序技术的飞速发展，液体活检技术、液芯技术等在肿瘤的早期筛查中日益重要，相信在不久的将来，在恶性肿瘤的早期诊断、预测转移、疗效监测、预后评估、以及个体化医疗方案制定等方面将发挥更大作用。