0 引言

据世界卫生组织统计，原发性肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）在世界范围内发病率列第7位、死亡率列第4位^[1]，在中国分列第3、第2位^[1]。HCC间质微环境是一个非常庞杂的体系，包括结缔组织、免疫细胞、细胞因子及血管微环境等，是HCC局部的间质内环境，贯穿于HCC发生发展的全过程。有研究表明^[2]，间质微环境在HCC的演进过程中起着至关重要的作用。Toll样受体3（Toll-like receptor 3, TLR3）为TLRs家族的重要成员。最近关于HCC的研究中对通过激活TLR3信号通路引起细胞凋亡和（或）使细胞毒性T细胞趋向HCC肿瘤床以发挥其杀伤作用^[3-4]已达成共识。本研究通过免疫组织化学染色技术检测102例HCC间质中平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的癌相关肌纤维母细胞、免疫活性细胞（CD3表达的T细胞、CD68表达的Kupffer细胞、CD56表达的自然杀伤NK细胞、CD21表达的树突状细胞DCs、CD117表达的肥大细胞）和CD34标记的血管内皮细胞，以及HCC细胞中TLR3表达，分析HCC中间质微环境与TLR3表达的相关性及其对预后的影响，探讨间质微环境在HCC演进过程中的重要作用。

1 资料与方法 1.1 患者资料

由南通大学附属医院、南通市肿瘤医院和南通市第三人民医院共同提供的2003年1月1日至2004年12月31日118例手术切除的HCC石蜡标本。所有研究病例均具有完整的临床病理资料，术前均未行放化疗。出院后对118位患者每月采用信件、电话两种方式进行一次随访，随访率100%，其中收到完整回访信69例、完整电话随访93例、二者均成功者60例，总计随访成功102例，随访成功率86.4%（102/118），随访时间≥60月。结果显示102例HCC中，生存时间 < 5年65例，≥5年37例。男84例，女18例； < 50岁52例，≥50岁50例；乙型肝炎表面抗原（HBsAg）（-）71例、（+）31例。

1.2 组织芯片制作及免疫组织化学染色

人体HCC组织芯片的制备利用已有专利技术^[5]。免疫组织化学染色采用SP法，用已知的阳性切片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。结果判断：参考Hercept Test^[6]的标准进行评分（阳性为相应部位显棕黄色颗粒，结构清晰及显色强于背景，不显色或与背景无差别显色者为阴性）。每例切片至少由两名有经验的病理医师随机镜检观察至少5个高倍镜（10×40）视野，计数每个视野中阳性细胞的百分率。根据Weidner^[7]方法：任何一个呈CD34阳性的单个内皮细胞和（或）内皮细胞簇都可直接作为一个单位来计数，而凡是直径比8个红细胞平均直径大的管腔和（或）管腔具有较厚平滑肌的一定不可予以计算在内。于100倍镜下选取微血管最密集的3个视野计数微血管数目，即为微血管密度（microvessel density, MVD）值。

1.3 统计学方法

采用SPSS19.0统计软件。卡方检验分析各指标，免疫组织化学检测百分率结果，运用Spearman等级相关分析有关指标间的互相关系。用Log rank检验行单因素分析具随访结果的病例且作出生存曲线（Kaplan-Meier）。P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 HCC中TLR3的表达

免疫组织化学结果显示TLR3主要表达于肿瘤细胞胞膜或胞质，见图 1。

2.2 HCC中间质微环境与TLR3表达的相关性研究

2.2.1 HCC中癌间质免疫活性细胞反应与TLR3表达的相关性

本组HCC间质中CD3、CD68、CD56、CD21和CD117表达见图 2。本组HCC中T细胞、Kupffer细胞、NK细胞和DCs与TLR3表达呈正相关；肥大细胞与TLR3表达呈负相关，见表 1。

2.2.2 HCC中癌间质CAFs反应与TLR3表达的相关性

HCC间质中CAFs表达见图 3。α-SMA阳性的CAFs与TLR3表达呈负相关，见表 2。

2.2.3 HCC中间质MVD与TLR3表达的相关性

CD34表达于HCC间质微血管内皮细胞膜或细胞质中，见图 3。HCC中MVD与TLR3表达差异有统计学意义（χ²=31.662, P < 0.01），并且呈显著负相关（r=-0.378, P < 0.01），见表 2。

2.3 HCC间质微环境反应与预后的相关性

2.3.1 HCC间质免疫活性细胞反应与预后的相关性

HCC中CD68阳性的Kupffer细胞反应和CD56阳性的NK细胞反应与预后呈正相关；CD117阳性的肥大细胞反应与预后呈负相关。Kaplan-Meier生存曲线结果显示CD68阳性的Kupffer细胞越多预后越好（P < 0.01）；CD56阳性的NK细胞越多预后越好（P < 0.01）；CD117阳性的肥大细胞越多预后越差（P < 0.01）, 见表 3、图 4。

2.3.2 HCC间质CAFs反应与预后的相关性分析

HCC中α-SMA阳性的CAFs与预后呈负相关，见表 4、图 5。

2.3.3 HCC间质MVD反应与预后的相关性分析

本组HCC生存≥5年者间质MVD较 < 5年者显著减少（χ²=8.0940, P < 0.05），且与预后呈负相关趋势，但差异无统计学意义（r=-0.1693, P > 0.05），见表 4、图 6。

3 讨论

HCC微环境包括HCC细胞和间叶细胞及它们的表达产物、代谢物质等。HCC间质指的是上述除HCC细胞以外的所有成分。

HCC微环境中间质对HCC细胞的影响是一把双刃剑，对HCC的发展表现为或促进或抑制的作用，反之HCC细胞也可导致间质发生改变。对于HCC微环境的研究表明HCC间质是上皮细胞-间充质转化（epithelial mesenchymal transition, EMT）乃至HCC复发转移所必需^[2]。HCC微环境的基质细胞主要有免疫细胞、CAFs和血管生成细胞3个部分组成。

已知TLRs对先天性免疫和获得性免疫能同时进行调节^[8]。各种免疫细胞均能表达TLRs，甚至非免疫细胞也有TLRs的表达^[9]。TLR3隶属于TLRs家族，哺乳动物细胞表面^[10]及细胞内囊泡^[3]均可见其表达。人类TLR3基因含有5个外显子，定位于4q35。

本研究检测到73例TLR3阳性表达于HCC细胞（总病例为102例），阳性率71.57%，比报道的略高^[11]，可能的原因一是本组病例Edmondson’s分级Ⅰ~Ⅱ级比例较高，二是本地区HCC常为慢性乙型肝炎后肝癌，乙肝病毒（hepatitis B virus, HBV）双链可使TLR3激活引起其表达增加等。

间质微环境中的免疫杀伤细胞负向调节着肿瘤的发生发展，其中最具代表性的为杀伤性T细胞，其次为NK细胞。在机体免疫系统对抗肿瘤的作用中，T细胞是排头兵，机体抗肿瘤反应的强度在一定程度上可从其数量和功能上反映出来。Faraji等研究显示肿瘤细胞表面表达的cadml能够抑制肿瘤细胞肺转移，并且对于肺转移的抑制作用依赖于CD8+T细胞的功能^[12]。Bidwell等研究显示CD8+T细胞在乳腺癌转移特异性的免疫监视机制中发挥重要作用，肿瘤细胞中W7的表达能够抑制干扰素（interferon, IFN）介导的骨转移，去除CD8+T细胞和NK细胞能够使骨转移恢复，并缩短无转移生存时间^[13]。巨噬细胞如浸润于肿瘤间质微环境中称为肿瘤相关巨噬细胞（tumor associated macrophages, TAM），Kupffer细胞即HCC中的TAM，对癌细胞起直接杀伤作用。TAM主要表现为促炎表型，还可以通过调节其他免疫细胞（由其分泌的细胞因子或细胞趋化因子介导）^[14-16]来发挥其抗肿瘤活性。DCs是肿瘤间质微环境中的抗原提呈细胞（Antigen presenting cells, APCs），其功能是为T细胞、NK细胞和TAM提呈抗原，间接调节肿瘤局部的免疫反应^[17]。

本研究观察到HCC间质微环境中T细胞、NK细胞、Kupffer细胞和DCs与TLR3表达呈正相关，并且肿瘤局部Kupffer细胞和NK细胞反应与患者预后呈正相关，而已知TLR3表达对HCC起免疫正调节作用，提示T细胞、NK细胞、Kupffer细胞和DCs能促进HCC局部抗肿瘤的免疫反应。本研究中T细胞反应与患者预后未呈相关性，可能系由间质中Kupffer细胞活性较强，消化了部分T细胞释放出的CD3所致；而DCs正是主要通过为T细胞提呈抗原发挥作用，所以本研究中DCs反应与患者预后亦未呈相关性。

肥大细胞可能通过以下几种途径促进肿瘤发展：（1）对正常信号通路的扰乱；（2）促进肿瘤性血管生成；（3）诱发免疫抑制状态；（4）分泌释放促肿瘤的生长因子^[18]。本组HCC中肥大细胞反应与TLR3表达呈负相关，表明肥大细胞与TLR3对HCC的作用具有拮抗性，因此提示肥大细胞对HCC起免疫负调节作用，同时也印证了本研究中肥大细胞反应与患者预后呈负相关的结果。

正常组织中的成纤维细胞不活跃，而HCC间质微环境中的成纤维细胞（即类似CAFs，表达α-SMA）相对较活跃，分泌大量基质且能促进基质沉积形成HCC硬化背景^[19]，构成整个HCC微环境的中心骨架。本研究观察到HCC中α-SMA阳性的CAFs与TLR3表达呈负相关，证明TLR3能抑制HCC间质的纤维化，其可能的途径有：HCC间质微环境中免疫活性细胞的抗病毒免疫反应；使CAFs功能受抑以减少基质分泌和（或）减缓沉积速度。本组HCC中CAFs与预后呈负相关，证明CAFs能促进肿瘤细胞的生长与转移^[20-21]，同时也表明HCC间质微环境中的CAFs可以被HCC细胞TLR3表达的信号分子通过旁分泌抑制其表达α-SMA，减少HCC硬化背景、脉管浸润，提高HCC患者生存。

HCC不同于其他上皮性恶性肿瘤的是其间质富于血管，所以其主要转移途径并非淋巴道而是血道。研究显示门静脉内微瘤栓形成是HCC主要的转移形式^[22]，因此血管（尤其是门静脉）是HCC浸润、扩散和转移的高速通道。GUO等^[23]研究表明21-核苷酸或更长的dsRNA通过激活HCC细胞中TLR3而非RNAi机制发挥抗血管生成作用。本研究发现HCC中MVD与TLR3表达呈负相关，而且与患者预后呈负相关，表明MVD与TLR3对HCC的作用相拮抗，同时两者之间又相互影响，相互制约。

提高对HCC微环境的认识，可以更好地了解HCC的发生机制，揭示HCC的发展规律，有利于开发全新有效的抗肿瘤治疗。不久的将来，多种以HCC微环境为靶点的治疗手段将不断出现，如重构HCC血管微环境的“饥饿疗法”、干扰HCC免疫微环境的“扶正祛邪疗法”等，这些措施将提高抗HCC的疗效，成为目前HCC治疗的有益补充。