0 引言

乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤，全球每年新发乳腺癌病例约115万，占所有新发癌症病例数的23%，每年有350 000女性死于乳腺癌，为第二位常见恶性肿瘤^[1]。探讨免疫在肿瘤发生发展中的作用，并利用其进行肿瘤的诊断和治疗，一直是肿瘤研究的重要领域。作为肿瘤微环境有机整体的主要组成部分，免疫微环境可直接或间接地影响肿瘤的发生发展，其作用受到越来越多的关注^[2]。我们的前期研究发现，乳腺癌肿瘤免疫微环境与乳腺癌外周血细胞基因表达模式存在相似性^[3]，这种相似即是肿瘤局部免疫状态在外周免疫系统的映射。外周血由众多免疫细胞组成，是机体外周免疫防御体系的基本要素。乳腺癌演进过程中，免疫细胞由外周血招募至肿瘤局部，穿越血管内皮进入肿瘤间质，成为肿瘤浸润性免疫细胞，构成了肿瘤免疫微环境，发挥抗肿瘤效应的同时也为肿瘤细胞的生长和转移提供生长因子、基质重塑因子和新生血管^[4-6]。最近的研究表明，肿瘤细胞可通过招募外周白细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞等，刺激产生炎性反应及中性粒细胞胞外诱捕网络（neutrophil extracellular traps, NETs）的形成，损伤血管内皮，继而促进肿瘤的生长、转移及远处器官损害^[7-8]。

本研究利用基因表达综合数据库（gene expression omnibus, GEO）^[9]中的基因芯片数据，分析乳腺癌上皮组织及外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）基因表达谱，构建两者“交叉对话”的蛋白质相互作用网络，评价乳腺癌对外周免疫系统的整体影响，在系统水平深入了解乳腺癌细胞与免疫系统之间的相互作用，为乳腺癌个体化治疗及预后监测提供潜在的分子靶点。

1 材料与方法 1.1 材料

数据来源于NCBI的GEO数据库，乳腺癌上皮组织登录号为GSE10797^[10]。由Casey等提交，共28个浸润性乳腺癌组织样本，5个癌旁正常组织样本。所有样本均经病理证实，并采用激光捕获显微切割技术，从乳腺癌与正常乳腺组织中纯化肿瘤上皮和正常上皮用于基因芯片研究。乳腺癌外周血单个核细胞登陆号为GSE27562^[10]，由LaBreche HG等提交，包括57例乳腺癌患者和31例乳腺X线摄影诊断为阴性的健康者外周血标本。

1.2 方法

1.2.1 差异表达基因分析

采用GEO数据库的GEO2R在线分析工具进行差异表达基因分析（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）。该在线工具基于R程序语言，应用t检验筛选差异表达基因。差异基因筛选标准：P≤0.05，校正P值即错误发现率（false discovery rate, FDR）≤0.1%，及基因表达值倍数变化（fold change, FC）≥2。

1.2.2 乳腺癌上皮细胞与外周免疫细胞对话分子的筛选

按以下流程进行：（1）利用The Universal Protein Resource（UniProt，http://www.uniprot.org）数据库^[11]，对乳腺癌上皮细胞差异表达上调的基因进行亚细胞定位。该数据库由Swiss-Prot和TrEMBL两部分数据库组成，数据库中的蛋白记录全部经过手工注释，是目前最为准确、冗余性最低的蛋白质数据库。亚细胞定位为“Cellular component/Subcellular locations/Secreted”的为分泌蛋白，即分子对话中的配体。（2）第一步中确定的差异表达上调的分泌蛋白，在UniProt及STRING^[12]（The Search Tool for The Retrieval of Interacting Genes）蛋白质相互作用数据库中检索其相互作用蛋白，保留在乳腺癌PBMCs中表达，同时亚细胞定位为“Cell Membrane”的基因，作为分子对话中的受体。（3）使用Cytoscape软件（V2.8.2）^[13]构建配体-受体蛋白质相互作用（protein protein interaction, PPI）网络。PPI网络由代表蛋白质的节点和代表相互作用的连线构成。通过Cytoscape软件的NetworkAnalyzer插件工具计算节点的边即互作连线的数量）筛选出网络中心节点。中心节点对应的蛋白质为具有重要生理调节功能的核心基因（蛋白质）。

1.2.3 基因功能注释和信号通路富集

筛选得到的对话分子采用DAVID（The Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery）^[14]在线平台进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG）通路富集分析^[15]和基因本体（gene ontology, GO）^[16]功能注释。P值及FDR均 < 0.05为差异有统计学意义的生物学通路。

2 结果 2.1 差异表达基因分析

两套数据差异表达基因中上调和下调基因的数目见表 1。

2.2 乳腺癌上皮细胞与外周血细胞对话分子筛选结果

Uniprot数据库显示，乳腺癌上皮细胞差异表达上调的730个基因中，99个亚细胞定位为“Secreted”。蛋白质相互作用分析显示，其中14个目前尚无已知的相互作用蛋白，余85个分泌蛋白有70个互作蛋白在PBMCs膜表达，共101个互作关系。Cytoscape软件构建PPI网络，见图 1，其中相互作用的边≥4的HUB基因有FN1（fibronectin 1）、ITGB1（Integrin, Beta 1）、FLT1（fms-related tyrosine kinase 1）、CXCR3（chemokine C-X-C motif receptor 3）、COPM（cartilage oligomeric matrix protein）和CXCL12（chemokine C-X-C motif ligand 12）。

2.3 对话分子的基因功能注释结果

用DAVID在线工具对155个对话分子进行GO功能注释和KEGG通路富集，P < 0.05作为显著性阈值，得到其参与的245个主要生物学过程和19条信号通路，按P值排序结果，见表 2~3。其中最显著的是细胞外基质与受体相互作用信号通路（ECM-receptor interaction）。富集到该通路的互作蛋白共16个，其互作关系，见图 2。

3 讨论

肿瘤细胞本身的遗传学改变及与微环境的相互作用是肿瘤演进的主要促进因素。除此之外，越来越多的研究表明，宿主针对肿瘤产生的复杂系统性应答，也是影响肿瘤结局的重要因素^[17]。而血管作为运输工具，贯穿全身各个器官，成为肿瘤引发宿主系统效应的中枢环节^[8]。通过血液循环，肿瘤细胞来源的因子可招募宿主远处组织（外周循环、骨髓、脾脏）的细胞向肿瘤部位趋化。这种肿瘤与宿主系统之间的相互作用，将会给肿瘤治疗及预后监测提供新策略^[18-21]。

疾病的发生与发展涉及诸多层次的复杂调控机制，通过对多种层次和来源的高通量组学数据的整合分析，从系统生物学的角度研究发病机制、寻找疾病靶点已经成为精准医学研究的重要发展方向，为疾病的个体化治疗和指导用药等提供新的理论依据^[22]。

本研究整合乳腺癌细胞与外周血单个核细胞基因表达谱，应用生物信息学的方法，筛选乳腺癌细胞与外周免疫细胞之间可能的交叉对话分子。得到85个乳腺癌细胞表达上调的分泌蛋白，对应70个外周血细胞膜蛋白，共101个相互作用关系。该结果显示，乳腺癌细胞相比正常乳腺细胞存在大量表达上调的分泌蛋白，并外周血细胞膜上均有相互作用的靶蛋白，这些分泌蛋白可能是癌细胞远程调控外周免疫细胞的信号分子。进一步生物学功能注释发现，对话分子主要涉及细胞黏附、细胞迁移、白细胞激活等生物学过程。

信号通路分析显示，乳腺癌上皮细胞与外周血单个核细胞的PPI网络，涉及细胞外基质与受体相互作用信号通路（hsa04512:ECM-receptor interaction）、黏着斑（hsa04510: Focal adhesion）、细胞因子-细胞因子受体相互作用通路（hsa04060: Cytokine-cytokine receptor interaction）、趋化因子信号通路（hsa04062：Chemokine signaling pathway），以及白细胞跨内皮迁移通路（hsa04670: Leukocyte transendothelial migration），其中以细胞外基质与受体相互作用信号通路最为显著。随着肿瘤的演进，免疫细胞由外周血招募至肿瘤局部，穿越血管内皮进入癌间质组织，成为免疫浸润性细胞，在肿瘤发生的早期发挥抗肿瘤效应，起到了免疫监视的作用。这些外周血招募来的免疫细胞发挥抗肿瘤效应的同时，也为肿瘤细胞的生长和转移提供了生长因子、基质重塑因子和新生血管。PPI信号通路富集分析提示，大量肿瘤细胞来源的因子，释放进入血循环，作用于外周血细胞，可能协助了外周血细胞向肿瘤组织的趋化，吸引其向肿瘤部位趋化，形成前炎性反应环境，建立起适宜肿瘤的微环境，为肿瘤所用。

作为免疫系统“运输工”的外周血，其主要细胞成分包括红细胞，白细胞和血小板，对其基因表达的检测，检测到的主要是血液循环中有核细胞的表达丰度，故肿瘤患者相对于健康者的外周血表达差异是由于白细胞表达差异造成的^[23]。上述富集的生物学过程及信号通路提示，乳腺癌细胞产生的分泌蛋白，刺激了免疫系统产生应答，而这种应答在外周血中存在明显的表现。

纤维连接蛋白1（fibronectin 1, FN1）为细胞外基质分子，参与基质重塑，细胞黏附和细胞迁移，可通过调节肌动蛋白聚合而影响细胞的运动。多数研究表明FN1在乳腺癌中高表达^[24-25]，参与了乳腺癌细胞与肿瘤微环境中免疫细胞的相互作用^[26]。β1-integrin（ITGB1）属于整联蛋白家族，该家族蛋白为跨膜受体，介导细胞黏附，细胞和细胞外基质的相互作用及白细胞迁出血管内皮等。ITGB1广泛表达于多种白细胞，如T细胞、单核细胞、粒细胞^[27-28]。有研究表明，β1-integrin介导骨髓来源的细胞向纤连蛋白富集的微环境趋化，协助肿瘤细胞转移^[29]。本研究显示，FN1、ITGB1分别在乳腺癌上皮细胞和外周血细胞中表达上调，并在交互作用网络中均拥有6个相互作用蛋白，处于网络的核心地位，提示两者可能是乳腺癌细胞对外周免疫细胞远程调控的主要信号，干预这种相互作用，可能改变免疫细胞向肿瘤局部的趋化，从而影响肿瘤的结局。

综上所述，本研究应用生物信息学方法寻找到乳腺癌细胞与外周免疫细胞之间的交叉对话分子，这些交互作用是肿瘤细胞建立其周围免疫微环境的基础，有望为乳腺癌的免疫治疗及预后监测提供新的分子靶点和新的思路。但高通量技术所产生的结果较多，以及统计方法的局限性，不可避免地出现一些假阳性结果，因而需要进一步验证。同时基因表达谱检测的基因数量有限，需采用更高的检测通量以及更广泛的检测范围，如RNA-seq^[30]，发现未知转录本、稀有转录本及其他调控因素^[31]等，对该互作网络予以补充和完善。