2017, Vol. 44文章信息
- 自噬介导葫芦素E对乳腺癌细胞Bcap-37的细胞毒作用
- Autophagy is Involved in Anticancer Effects of Cucurbitacin E on Human Breast Cancer Cell Bcap-37
- 肿瘤防治研究, 2017, 44(3): 172-176
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(3): 172-176
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2017.03.004
- 收稿日期: 2016-09-02
- 修回日期: 2016-11-25
引用本文 |
2. 311200 杭州，萧山区第一人民医院心内科;
3. 310022 杭州，浙江省肿瘤医院肿瘤内科
2. Department of Cardiology, Hangzhou Xiaoshan First People's Hospital, Hangzhou 311200, China;
3. Department of Oncology, Zhejiang Cancer Hospital, Hangzhou 310022, China
乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤，是导致世界范围内女性肿瘤患者死亡的首要原因[1]。乳腺癌治疗面临一系列的难题，如疾病复发、转移、耐药等。植物单体在抗肿瘤治疗中发挥重要作用，如紫杉醇、长春新碱、表鬼臼毒素等[2]。因此从植物中寻找抗肿瘤药物成为一种可能。
葫芦素E（Cucurbitacin E, CuE），一种从葫芦科植物中提取的三萜类化合物，能抑制多种肿瘤，如前列腺癌[3]、卵巢癌[4]、胰腺癌[5]、淋巴瘤[6]、膀胱癌[7]、口腔鳞癌[8]、结直肠癌[9]等。亦有报道葫芦素E通过G2/M细胞周期阻滞、凋亡抑制乳腺癌细胞[10-11]；通过抑制细胞迁移及侵袭抑制乳腺癌细胞转移[12]。
据文献报道，自噬在肿瘤治疗中发挥重要作用[13]。多种植物提取抗肿瘤药物可诱导乳腺癌细胞产生自噬现象，包括植物单体紫杉醇[14]、榄香烯[15]等。因此，本研究探索葫芦素E可否诱导乳腺癌产生自噬，并研究自噬的潜在作用，进一步解释葫芦素E抗乳腺癌的分子机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器葫芦素E（上海展舒化学科技有限公司），LC3-B小鼠抗人单克隆抗体、GAPDH鼠抗人单克隆抗体、羊抗兔二抗（美国Cell Signal公司），化学发光荧光影像分析仪（日本FUJIFILM公司），流式细胞仪（FCM）（美国BD公司），超微量分光光度计（美国Thermo Scientific公司），透视显微镜（日本HITACHI公司）。
1.2 细胞培养乳腺癌细胞Bcap-37置于10%胎牛血清的DMEM高糖培养液，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，取对数生长期细胞进行实验。
1.3 MTT法检测细胞增殖活性葫芦素E（终浓度0、0.1、1、10、100 μmol/L）处理乳腺癌Bcap-37细胞24 h后，每孔加入MTT 15 μl，室温孵育4 h，每孔加DMSO 100 μl，轻微振荡10 min，立即于酶标仪上570 nm波长检测各孔吸光度值，根据各复孔吸光度值，计算各组细胞生长抑制率（%）。细胞抑制率=（对照组OD570-实验组OD570）/对照组OD570×100%。实验重复3次。
1.4 细胞周期及凋亡检测Bcap-37细胞（4×105个）接种于六孔板，予以葫芦素E（0、1 μmol/L）处理24 h后，收集细胞。加入70%冰冻酒精固定，置4℃冰箱过夜。然后PI染色细胞避光30 min，用流式细胞仪检测细胞周期时相。另用Annexin/PI双标法检测细胞凋亡，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.5 Western blot检测将一定数量乳腺癌细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后按照实验设计加葫芦素E（0、1 μmol/L）处理24 h。中止培养后，用4℃预冷的PBS（0.01 Mol pH7.4）洗涤细胞3次。每孔加80 μl含PMSF和磷酸酶抑制剂的裂解液，置冰上裂解30 min。离心取上清液分装于EP管中，其中2 μl用Nanodrop 2 000蛋白浓度定量，其余蛋白混合物与蛋白上样缓冲液混匀，于100℃水浴5 min，-80℃保存备用。本实验选择10%SDS-PAGE分离胶。4%的浓缩胶。选择恒压80 V/120 V。将活化的PVDF膜和胶置入转膜装置，恒流240 mA转膜（1.5~2）h。用5%脱脂牛奶室温封闭PVDF膜1 h。加入一抗，置于染色湿盒中4℃过夜，TBST室温下脱色摇床上洗2次，每次10 min；TBS洗一次，10 min。二抗室温孵育1 h，用TBST洗脱，加ECL避光孵育5 min，化学发光荧光影像分析仪显影，保存图像进行分析。
1.6 透射电子显微镜检测Bcap-37加入1 μmol/L葫芦素E处理24 h，用与药物同体积的DMSO作阴性对照。24 h后停止培养，用2.5%的胰酶消化细胞，经PBS洗涤后用2.5%戊二醛固定，1%锇酸后固定。分别经酒精、丙酮脱水，纯包埋剂包埋。制作超薄切片（约120 nm厚），4%醋酸铀染色20 min，枸橼酸铅染色5 min后，透射电子显微镜下观察细胞超微结构。
1.7 统计学方法每组实验重复3次。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，检验方差齐性，均数间比较用t检验，P < 0.05为差异有统计意义。
2 结果 2.1 葫芦素E对Bcap-37细胞生长的影响葫芦素E对乳腺癌Bcap-37细胞生长有较明显的抑制作用，并呈剂量依赖性，用药各组与对照组相比差异均有统计学意义（P < 0.05），见图 1。
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| 图 1 葫芦素E对Bcap-37细胞的增殖抑制作用 Figure 1 Cucurbitacin E inhibited proliferation of Bcap-37 cells |
为探讨葫芦素E对乳腺癌细胞周期分布的影响。葫芦素E处理Bcap-37细胞后，Bcap-37细胞周期发生明显改变，表现为G2/M期比率明显增高。与对照组相比，经1 μmol/L葫芦素E处理Bcap-37的G2/M期细胞百分率从21.5%增长至43.13%。结果证明，葫芦素E可使Bcap-37细胞周期抑制于G2/M期，见图 2。
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| CuE: Cucurbitacin E 图 2 葫芦素E诱导Bcap-37细胞G2/M细胞周期阻滞 Figure 2 Cucurbitacin E induced Bcap-37 cell cycle arrest at G2/M phase |
与对照组相比，Bcap-37经1 μmol/L葫芦素E处理24 h后出现大量早期凋亡细胞，早期凋亡细胞百分率从3.17%增加至15.04%，见图 3，证明葫芦素E可诱导Bcap-37凋亡。
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| 图 3 葫芦素E诱导Bcap-37细胞凋亡 Figure 3 Cucurbitacin E induced apoptosis of Bcap-37 cells |
通过透射电子显微镜观察扫描，经葫芦素E处理后的Bcap-37细胞胞质中出现膜性泡状结构，内有细胞器，为典型的自噬泡，见图 4。Western blot结果显示：Bcap-37细胞经葫芦素E处理后可观察到LC3-Ⅱ表达上调，且P62表达下降，见图 5，提示Bcap-37细胞内LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变。
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| A: control group; B, C, D: drug treatment group (A, B: ×6 200; C: ×30 000; D: ×39 000); Nu: nucleus; arrow represented autophagosomes; the changes in ultra-microstructure of Bcap-37 cells treated with Cucurbitacin E were observed under electron microscopy 图 4 葫芦素E可诱导Bcap-37细胞发生自噬 Figure 4 Cucurbitacin E induced autophagy of Bcap-37 cells |
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| 图 5 葫芦素E处理前后Bcap-37细胞中LC3-Ⅰ/Ⅱ和P62蛋白的表达 Figure 5 Expression of LC3-Ⅰ/Ⅱand P62 in Bcap-37 cells with or without Cucurbitacin E treatment |
为明确自噬在葫芦素E抑制Bcap-37增殖中的作用，我们在实验中添加自噬抑制剂氯喹，发现与对照组比较，单用氯喹组对细胞增殖活性无显著影响，而10 μmol/L氯喹与1 μmol/L葫芦素E联用时，其抑制增殖的作用大于单用葫芦素E，差异具有显著统计学意义（P=0.00165），见图 6C，同样经氯喹和葫芦素E联合处理后的Bcap-37凋亡细胞亦较单用葫芦素E明显增多，见图 6A、B。因此我们认为葫芦素E可诱导乳腺癌Bcap-37产生细胞保护性自噬。
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| CQ: Chloroquine 图 6 自噬抑制剂增加葫芦素E对乳腺癌Bcap-37的抑制作用 Figure 6 Autophagy inhibitor augmented Cucurbitacin E-induced cytotoxicity in Bcap-37 cells |
众多研究发现植物单体是理想的抗肿瘤药物，通过抑制肿瘤细胞增殖阻止其进展。而葫芦素E是一种从葫芦科植物中提取的植物单体，已有研究报道葫芦素E可抑制多种肿瘤细胞。葫芦素E亦对乳腺癌细胞有抑制作用，有报道葫芦素E通过G2/M细胞周期阻滞、凋亡抑制乳腺癌细胞[10-11]；通过抑制细胞迁移及侵袭抑制乳腺癌细胞转移[12]。但其抑制乳腺癌具体分子机制尚不明确，因此本研究进一步探讨其机制。
本研究再次证实，葫芦素E呈剂量依赖性显著抑制乳腺癌细胞Bcap-37增殖，并可诱导乳腺癌Bcap-37细胞凋亡及G2/M期阻滞。已有数据证明葫芦素E是潜在的乳腺癌治疗药物[16]。
在葫芦素家族中，葫芦素B、葫芦素D均可诱导肿瘤细胞产生自噬现象[17-18]，而葫芦素Ⅰ可诱导恶性胶质瘤细胞产生保护性自噬[16]。本研究观察到乳腺癌Bcap-37经葫芦素E处理后出现自噬现象。而LC3是自噬的特异性标记，随着自噬的发生，原存在于胞质中的LC3-Ⅰ转化为与自噬泡形成密切相关LC3-Ⅱ。本研究发现，在经葫芦素E处理的乳腺癌Bcap-37细胞中出现LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转变的现象。已有文献报道，阻断自噬进程可使LC3-Ⅱ降解抑制，从而增加细胞内Lc3-Ⅱ表达[19]。但本研究运用透射电子显微镜观察超微结构，发现经葫芦素E处理的乳腺癌细胞胞质内有自噬泡，证实葫芦素E是诱导乳腺癌细胞产生自噬而不是抑制自噬。P62是一种自噬降解底物，可以通过自噬特异性降解，本研究发现经葫芦素E处理后的Bcap37细胞中P62表达降低，进一步证实葫芦素E能诱导乳腺癌细胞产生自噬。
自噬可诱导肿瘤细胞死亡，被认为是一种程序化死亡。但近期研究发现自噬亦可作为一种防御机制保护肿瘤细胞度过不利环境。本研究运用氯喹阻断自噬的中间环节，可显著增加葫芦素E对Bcap-37细胞增殖抑制作用，说明葫芦素E诱导Bcap-37细胞发生自噬可能是细胞的一种保护性反应，以逃避药物对肿瘤细胞的杀伤作用。通过阻断自噬增加葫芦素E对乳腺癌细胞的毒性作用。
与葫芦素E类似，众多抗肿瘤药物可诱导肿瘤细胞自噬，如替莫唑胺[20]、他莫昔芬[21]、雷帕霉素[22]等。已有研究报道，某些药物诱导产生的自噬起细胞保护作用，如曲妥珠单抗诱导Her-2阳性乳腺癌产生细胞保护性自噬[23]。苦参碱诱导骨肉瘤细胞自噬，其通过ERK信号通路拮抗细胞凋亡[24]。因此抗肿瘤药物联合自噬抑制剂是一种潜在的抗肿瘤治疗策略。综上所述，葫芦素E通过促进凋亡抑制乳腺癌细胞增殖，是一种潜在的抗乳腺癌药物。抑制自噬可增加葫芦素E对乳腺癌细胞增殖的抑制作用，但是葫芦素E诱导的凋亡与自噬的相互作用分子机制仍需进一步研究。
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