2017, Vol. 44文章信息
- 维生素C联合三氧化二砷对膀胱癌T-24细胞株的作用
- Combined Application of Vitamin C and Arsenic Trioxide in Inhibiting Bladder Cancer Cell Lines T-24 in vitro
- 肿瘤防治研究, 2017, 44(2): 103-107
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(2): 103-107
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2017.02.005
- 收稿日期: 2016-06-20
- 修回日期: 2016-09-19
引用本文 |
2. 541000 桂林，桂林医学院附属医院泌尿外科;
3. 541000 桂林，桂林医学院生物技术学院;
4. 044000 运城，运城市中心医院泌尿外科
2. Department of Urology, Affiliated Hospital of Guilin Medical College, Guilin 541000, China;
3. College of Biotechnology, Guilin Medical College, Guilin 541000, China;
4. Department of Urology, Yuncheng Central Hospital, Yuncheng 044000, China
膀胱癌是最常见的男性泌尿系统肿瘤，其发病率居于首位，近几年有逐渐上升的趋势[1]。临床常用的如卡介苗、丝裂霉素、表柔比星等抗有丝分裂药物[2]，是常见的膀胱灌注药物，但它们不同程度上存在不良反应及较高的肿瘤复发率，因此，寻找安全且有效的膀胱癌药物是肿瘤治疗领域的瓶颈。三氧化二砷（As2O3）是中药砒霜的主要有效成分[3]，具有杀伤白血病细胞、促进白血病细胞凋亡和诱导细胞分化三重作用[4]。国外研究显示，维生素C不仅对化疗药物所致的细胞损伤有保护作用，也对As2O3抗癌作用具有协同性[5-6]。本实验旨在探讨维生素C联合三氧化二砷对膀胱癌T-24细胞增殖、凋亡作用及其机制，为临床用药提供参考。
1 材料与方法 1.1 材料人T-24膀胱癌细胞株（中国科学院上海生科院细胞资源中心）、DMEM培养液和胎牛血清（美国Gibcol公司）、注射用As2O3（北京双鹭药业）、维生素C（广州南国药业有限公司）、CCK-8试剂盒（美国Sigma公司）、RT-PCR反应体系购自TaKaRa公司[宝生物工程（大连）有限公司]、caspase-3 mRNA和survivin mRNA引物（上海生工生物工程技术服务有限公司）、细胞裂解液和蛋白定量试剂盒（美国PIERCE公司）。
1.2 实验分组分为6组，其中As2O3组分为3组，分别加入0.4 μg/ml、4 μg/ml（临床常用量）、40 μg/ml的As2O3；维生素C组加入400 μg/ml（临床常用量）的维生素C；联合组加入400 μg/ml维生素C+0.4 μg/ml As2O3，对照组不做特殊处理。
1.3 细胞培养将T-24细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，内含100 u/ml青霉素、100 μg/ml链霉素，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，用胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行后续实验。
1.4 T-24细胞增殖曲线测定取对数生长期T-24细胞，接种到96孔板中，置于CO2的培养箱中24 h后，分别加入维生素C（400 μg/ml）组，不同浓度As2O3（0.4、4、40 μg/ml）组，联合（400 μg/ml维生素C+0.4 μg/ml As2O3）组，对照组不做特殊处理，每组设3个复孔。连续培养7天后每孔加入10 μl CCK-8液，继续培养2 h后吸出上清液，测定450 nm处吸光度（OD）值，用MTS法绘制细胞生长曲线。
1.5 细胞周期及凋亡率的测定取对数生长期细胞接种于10 cm培养皿中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h贴壁后，加入相应药物作用，对照组不加药物，培养24 h后收集贴壁细胞制成单细胞悬液，70%冷乙醇固定，PBS洗涤，RNase A 37℃孵育30 min。离心后弃上清液，加入PI染液，冰浴30 min，染色后筛网过滤，上流式细胞仪检测，Multicycle DNA分析软件测定。
1.6 survivin mRNA、caspase-3 mRNA测定取对数生长期T-24细胞，按对照组、维生素C（400 μg/ml）组、As2O3（0.4 μg/ml）组、As2O3（4 μg/ml）组、As2O3（40、μg/ml）组、联合（400 μg/ml维生素C+0.4 μg/ml As2O3）组，分别培养48 h后收集细胞，TRIzol试剂盒提取总RNA，反转录制备cDNA进行PCR实验。caspase-3 mRNA上游引物：5'-TGACCGAGGCTACATFCAGATGACACC-3'，下游引物：5'-CAAGAGAGTTGGGCTGACCAGAAACAC-3'，扩增产物365 bp；suvivin mRNA上游引物：5'-CCCTTTCTCAAGGACCACCGCATC-3'，下游引物：5'-GCCAAGTCTGGCTCGTTCTCAGTG-3'，扩增产物133 bp；β-actin上游引物：5'R 11;AGTGTGACGTGGACATCCGCA-3'，下游引物：5'-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3'，扩增产物243 bp。基因扩增后均取扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，应用凝胶成像系统对电泳条带进行扫描分析，计算相对表达水平。
1.7 Western blot法检测suvivin、caspase-3蛋白水平按照PIERCE公司说明书步骤，细胞裂解液提取细胞蛋白，蛋白定量试剂盒定量，随后将蛋白样品用10% SDS-PAGE凝胶电泳，当蛋白进入分离胶后湿转法进行转膜。5%脱脂奶粉封闭1 h后加入一抗，4℃孵育过夜，之后加入二抗孵育1 h，ECL荧光显色后暗室X片曝光。
1.8 统计学方法应用SPSS19.0统计软件处理，所用实验均重复3次，实验数据用（x±s）表示，采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 各组药物作用后对T-24细胞增殖活性的影响联合组、维生素C（400 μg/ml）组、As2O3（4 μg/ml）组及As2O3（40 μg/ml）组均对T-24细胞增殖有显著抑制作用，且随着时间的延长而增加，呈时间依赖性。联合组对肿瘤细胞的抑制能力强于维生素C（400 μg/ml）组、As2O3（4 μg/ml）组及As2O3（40 μg/ml）组，见图 1。
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| 图 1 T-24细胞在各组中的增殖情况 Figure 1 The proliferation of T-24 cell in different groups |
T-24细胞经过各组药物作用24 h后，联合组细胞凋亡率明显高于其他各组。联合组将细胞阻滞在G0/G1期，与其他各组比较，差异有统计学意义，见表 1。
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As2O3能上调caspase-3 mRNA的表达，下调survivin mRNA的表达，作用随着剂量的增加而加强，但联合组则能明显下调survivin mRNA的表达，促进caspase-3 mRNA的表达，效果优于对照组、As2O3（0.4 μg/ml）组、As2O3（4 μg/ml）组，见图 2~3。
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| M: marker; 1: control group; 2: vitamin C(400μg/ml) group; 3: As2O3(0.4μg/ml) group; 4: As2O3(4μg/ml) group; 5: As2O3(40μg/ml) group; 6: combination group(400μg/ml vitamin C+0.4μg/ml AS2O3) 图 2 48 h后不同药物组中caspase-3因子的表达 Figure 2 Expression of the caspase-3 gene in different groups after 48h of culture |
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| M: marker; 1: control group; 2: vitamin C(400μg/ml) group; 3: As2O3(0.4μg/ml) group; 4: As2O3(4μg/ml) group; 5: As2O3(40μg/ml) group; 6: combination group（400μg/ml vitamin C+0.4μg/ml As2O3) 图 3 48 h后不同药物组中survivin因子的表达 Figure 3 Expression of the survivin gene in different groups after 48 h of culture |
As2O3能上调caspase-3蛋白的表达，上调survivin蛋白的表达，作用随着剂量的增加而加强，但联合组则能明显下调survivin蛋白的表达，促进caspase-3蛋白的表达，效果优于对照组、As2O3（0.4 μg/ml）组及As2O3（4 μg/ml）组，但与As2O3（40 μg/ml）组相比无明显变化，见图 4~5。
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| 1: As2O3(40μg/ml) group; 2: As2O3(4μg/ml) group; 3: As2O3(0.4μg/ml）group; 4: control group; 5: vitamin C(400μg/ml) group; 6: combination group(400μg/ml vitamin C+0.4μg/ml AS2O3) 图 4 48 h后不同药物组中β-actin、caspase-3蛋白的表达 Figure 4 Expression of the β-actin and caspase-3 protein in different groups after 48 h of culture |
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| 1: control group; 2: vitamin C(400μg/ml) group; 3: As2O3(0.4μg/ml) group; 4: As2O3(4μg/ml) group; 5: As2O3(40μg/ml) group; 6: combination group(400μg/ml vitamin C+0.4μg/ml As2O3) 图 5 48 h后不同药物组中survivn蛋白的表达 Figure 5 Expression of the survivin proteins in different groups after 48 h of culture |
As2O3治疗急性早幼粒细胞白血病取得极好效果后，随之有研究表明其在其他抗肿瘤治疗方面具有突出的效果[7]，已成为肿瘤治疗研究的热点之一。但是，As2O3不良反应较多，致死量及治疗量相接近，因此探讨AS2O3抗肿瘤机制对于其广泛应用于临床具有重要意义[8-9]。本研究发现As2O3对T-24细胞生长有抑制作用，呈剂量和时间依赖性，其机制可能与促使肿瘤细胞凋亡有关。目前，探讨肿瘤细胞凋亡的药物成为研究的热点与趋势，caspase是半胱氨酸蛋白酶家族成员之一，在细胞凋亡的过程中起关键作用[10]。细胞凋亡通路主要有线粒体通路、死亡受体通路、内质网通路,最后这三种通路汇聚到同一条通路，激活caspase-3并诱导细胞凋亡，因此，检测caspase-3的表达有助于早期提供细胞凋亡的证据[11]。survivin是目前最重要的凋亡抑制蛋白家族成员之一，它可直接或间接与caspase-3，caspase-7结合并抑制它们的活性，从而抑制细胞的凋亡。有研究显示caspase-3和survivin可能是As2O3作用的靶点。曾锦荣等[12]研究表明，As2O3能抑制肺癌细胞survivin的表达，抑制其增殖，还能上调caspase-3的表达，与剂量呈正相关。Haga等[13]研究发现caspase的激活只在对As2O3敏感的细胞系出现。
As2O3抑制肿瘤细胞生长的重要机制之一是阻滞细胞周期，它可调控一些关键蛋白，使细胞生长阻滞在G0/G1期，Li等[14]研究表明，伏立诺他和三氧化二砷单独应用可以抑制人急性早幼粒白血病细胞（NB4）的增殖并诱导细胞凋亡，联合应用可以提高效果，其机制可能与三氧化二砷增加组蛋白乙酰化作用，下调AKT蛋白激酶信号通路有关，但需要进一步研究。Beauchamp等[15]研究发现，三氧化二砷抗肿瘤机制可能为其联合半胱氨酸299抑制AMPK激酶的活性，从而增加哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian,target of rapamycin,mTOR）的活性。而mTOR是PI3K/AKT/mTOR信号通路中最重要的下游效应蛋白之一，通过AMPK信号途径调节细胞生长和增殖[16]。梁晓燕等[17]发现，在人宫颈癌HeLa细胞恢复LKB1（一种丝/苏氨酸蛋白激酶）表达后细胞增殖减慢，极性恢复，其可能的机制是增强内源性的AMPK信号通路的活性，进而抑制细胞周期G1/S转换。本研究发现，As2O3（4 μg/ml）组和As2O3（40 μg/ml）组使T-24细胞阻滞在G0/G1期，凋亡率明显高于As2O3（0.4 μg/ml）组、对照组，从而抑制细胞增殖，是否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路有待有进一步研究。同时，可抑制survivin mRNA、蛋白的表达，上调caspase-3 mRNA、蛋白的表达，与剂量呈正相关。但As2O3剂量过高可能对正常细胞产生毒性作用，从而限制了其临床应用。以As2O3为基础联合化疗为临床提供了新的思路。从细胞增殖曲线上看，As2O3（0.4 μg/ml）组对肿瘤增殖抑制作用弱于维生素C（400 μg/ml）组，这可能与维生素C在体内代谢情况，血药浓度及到达肿瘤组织的有效药物量有关；维生素C及As2O3在抗肿瘤方面存在争议，有研究表明单用维生素C临床剂量对肺腺癌裸鼠移植瘤没有明显的抑制作用。故本研究还需要进一步考虑深层次的机制。
维生素C可以清除体内有害氧自由基从而保护机体正常细胞，还可以进一步减少肿瘤细胞内本就缺乏的过氧化物酶，增加过氧化氢的产生，从而对肿瘤细胞产生杀伤作用[18]。正常组织细胞中过氧化物酶含量是肿瘤细胞的10~100倍，这有可能是维生素C杀伤肿瘤细胞的同时不损害正常细胞的重要原因。Fritz等[19]研究发现，低浓度维生素C可减少三氧化二砷化疗的不良反应。维生素C可使HeLa细胞阻滞在G0/G1期，抑制DNA合成而抑制细胞增殖。但有体外实验表明，低剂量对正常细胞有保护作用，而大剂量对细胞有杀伤作用，因此近年来维生素C被建议作用肿瘤药物的辅助治疗。
本实验提示，维生素C（400 μg/ml）组对T-24细胞有抑制效果，对survivin、caspase-3亦产生影响，但联合组抑制survivin mRNA、蛋白的表达，上调caspase-3 mRNA、蛋白的表达优于其他各组，抑制肿瘤增殖的效果明显，综上所述，维生素C与As2O3联用能更有效的促进膀胱癌T-24细胞的凋亡，其机制可能与上调caspase-3、下调survivin表达有关。本研究亦存在如下不足：具体抗肿瘤机制仍需探索，还需进行其他肿瘤的相关研究，为临床应用提供新方法奠定基础。
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