2017, Vol. 44文章信息
- CD147及其配体CypA在小鼠肝癌细胞Hepa1-6逃避T细胞免疫监视中的作用
- Role of CD147 and Its Ligand CypA in Hepatoma Carcinoma Hepa1-6 Cells Escaping from Immune Surveillance of T cells
- 肿瘤防治研究, 2017, 44(1): 17-22
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2017, 44(1): 17-22
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2017.01.004
- 收稿日期: 2016-04-25
- 修回日期: 2016-06-06
引用本文 |
2. 116044 大连，大连医科大学基础医学院
2. College of Basic Medical Science, Dalian Medical University, Dalian 116044, China
据世界卫生组织调查，肝癌居男性恶性肿瘤发病率第五位，女性恶性肿瘤发病率第七位[1]。CD147是一种属于免疫球蛋白超家族的跨膜糖蛋白，可参与多种生理和病理生理过程[2]，最典型的是作为细胞外基质金属蛋白酶诱导物（EMMPRIN）在组织重构、精子发生、神经形成及肿瘤转移中发挥作用。人类CD147分子具有269个氨基酸，细胞外区包含两个免疫球蛋白样结构域、三个糖基化位点并被高度糖基化[3]。研究表明，CD147在心血管疾病、阿尔茨海默病、免疫炎性反应、恶性肿瘤等疾病中呈高表达状态[4-6]。CD147可与亲环蛋白（cyclophilin, Cyp）结合促进免疫细胞趋化。亲环蛋白也称亲环素，发现于1984年，因其能与免疫抑制剂环孢菌素A（cyclosporinA, CsA）结合而得名。Cyp遍布于原核及真核生物中，而且含量丰富，在测定的人类所有正常和肿瘤组织中，均发现其存在[7]。CypA是亲环蛋白家族中含量最丰富的，是环孢菌素在细胞内的主要受体[8]。确定CD147作为细胞外Cyp信号受体[9]是对这一令人关注的分子生物学特性的新发现，近年来，CD147作为细胞外CypA和CypB的信号受体介导免疫细胞的趋化活性已得到证实[7]。
本研究旨在通过观察CypA对不同CD147表达水平的小鼠肝癌细胞的影响，以及对T细胞趋化作用的变化，探讨CypA和CD147分子的相互作用对肿瘤细胞和T细胞生物学行为的影响，对已有的肿瘤细胞逃避T细胞免疫监视的理论作以补充。
1 材料与方法 1.1 动物C57Bl/6j小鼠20只，雌性，6~8周，体质量（18±2）g，购于大连医科大学动物实验中心。
1.2 主要试剂DMEM培养液和RPMI 1640培养液均购自美国Gibco公司；FBS购自天津灏洋生物制品科技有限公司；DMSO购自美国Sigma公司；RIPA细胞裂解液和PMSF均购自碧云天生物有限公司；RNAiso Plus、反转录试剂盒和PCR试剂盒均购自宝生物工程有限公司；BCA蛋白含量检测试剂盒和CCK8试剂盒购自均凯基生物科技发展有限公司；NC膜购自美国Millipore公司；CD147shRNA购自上海吉玛公司；G418购自美国Calbiochem公司；重组小鼠CypA（50296-M08E）购自北京义翘神州生物技术有限公司；Anti-CD147（sc-25531）购自美国SANTA CRUS公司；Anti-GAPDH（AP0063）购自中国Bioworld生物科技有限公司；山羊抗兔IgG/HRP（ZDR-5306）购自北京中杉金桥生物技术有限公司；Anti-Mouse CD3e-PE（Catalog Number：12-0031；Clone：145-2C11）、Anti-Mouse CD19-FITC（Catalog Number：11-0193；Clone：eBio1D3）均购自美国eBioscience公司；ECL发光试剂盒购自美国Advansta公司。
1.3 主要实验器材低温超速离心机购自德国Eppendorf公司；CO2细胞培养箱购自美国Thermo Scientific公司；荧光显微镜购自日本Nikon公司；5 μm 24孔Transwell小室细胞培养板购自美国Corning公司；细胞培养皿及细胞培养板购自美国Corning公司；微量加样器购自德国Eppendorf公司；PCR仪购自美国Thermo Scientific公司；DYCZ-240型垂直板电泳槽、DYY-12型电泳仪和转膜仪均购自北京市六一仪器厂；凝胶成像分析系统购自美国Bio-Rad公司；酶标仪购自美国Thermo Electron Corporation公司；FACSealibur流式细胞仪购自美国BD公司；石蜡切片机JUNGRM2025购自德国Leica公司。
1.4 实验方法 1.4.1 细胞培养将小鼠肝癌细胞Hepa1-6接种于含10%胎牛血清（FBS），青霉素100 u/ml，链霉素100 μg/ml的DMEM培养液中，置于37℃、5% CO2的培养箱中，2天换液一次，取对数生长期细胞进行实验，用锥虫蓝拒染法检测活细胞数大于95%。
1.4.2 细胞转染及RNA干扰RNA干扰前24 h将Hepa1-6细胞培养于10%FBS的DMEM培养液中，使细胞达到60%~80%的汇合，将稀释好的含有绿色荧光蛋白（GFP）和G418抗性筛选标记的真核表达质粒载体pGPU6/GFP/Neo-CD147shRNA与Lipofectamine2000轻柔混匀，室温放置20 min，形成shRNA/Lip复合物，再将shRNA/Lip复合物加入到含有细胞和DMEM培养液的6孔板中，混合均匀。37℃、5%CO2培养箱中温育，6 h后更换培养液，24 h后更换含双抗的培养液，48 h后荧光显微镜下观察细胞转染效率。对转染后的细胞进行接种，接种当天，使用不添加G418的培养液；24 h后观察，待细胞完全贴壁后，对细胞进行换液处理，使用添加G418的完全培养液，G418终浓度为800 ng/μl；常规换液处理，维持G418浓度400 ng/μl；接种后第三周，培养皿内有单克隆形成；选取状态较好的克隆，将克隆移至96孔板进行培养，然后对克隆逐步进行放大培养，依次为96、24和6孔板，6、10 cm细胞培养皿，冻存细胞。
1.4.3 RNA提取和反转录PCR按产品说明书TRIzol法提取未转染组细胞（Hepa1-6）、转染含无义序列-shRNA的pGPU6/GFP/Neo载体组细胞（NC）及转染pGPU6/GFP/Neo-CD147shRNA后，经G418筛选得到的单细胞克隆（shRNA-C）的总RNA，并置于-80℃保存。反转录体系20 μl，包含RNA样品1 μg，按照TaKaRa反转录试剂盒说明书进行操作；反应条件为：25℃ 10 min，42℃ 60 min，99℃ 5 min，cDNA置于-20℃保存。PCR反应体系25 μl，反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，59℃退火40 s，72℃延伸50 s，循环25次；72℃延伸10 min，4℃保存2 h。取5 μl PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下凝胶成像。CD147和GAPDH的上下游引物见表 1。
用RIPA裂解细胞，14 000 g离心15 min取上清液，蛋白浓度由BCA法检测得出。煮沸蛋白样品8 min以使其变性，以每孔30 μg的蛋白含量上样，经浓缩胶为6%、分离胶为10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离。通过转膜仪将凝胶上的蛋白样品移至硝酸纤维素膜上，5%脱脂奶粉（用TBST配制）在室温环境中封闭2 h。分别与1:500兔抗小鼠CD147、GAPDH多克隆抗体4℃孵育过夜。用TBST洗膜3次，每次15 min。然后均匀滴加HRP标记的山羊抗兔IgG（1:3 000稀释）抗体，室温孵育1 h，再用TBST洗膜3次，每次15 min。滴加ECL发光液，于Bio-Rad凝胶成像分析系统检测结果。
1.4.5 CCK8法检测细胞增殖情况取96孔板，每孔加入100 μl含2 000个细胞的DMEM全培养液，37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24 h。按实验分组加入CypA，使其终浓度分别为0、1、10、100、200和500 ng/ml，培养24 h。每孔加入10 μl CCK-8溶液。用只加相同量细胞培养液和CCK-8溶液的孔作为空白对照，在细胞培养箱内继续孵育1 h。酶标仪450 nm测定吸光度值。
1.4.6 流式细胞仪分选小鼠T细胞实验断颈处死C57Bl/6j小鼠，75%乙醇浸泡消毒后取脾脏和淋巴结，用玻璃注射器芯在细胞筛上研磨，制备单细胞悬液。用15 ml离心管收集悬液，1 500 r/min室温离心5 min，弃上清液。根据细胞数，加入5~10 ml FACS液，混悬，锥虫蓝计数，1 500 r/min室温离心5 min，弃上清液，加入1 ml FACS液，混悬。加入Anti-Mouse CD3e-PE/Anti-Mouse CD19-FITC，4℃避光孵育30 min。再加入9 ml FACS液，颠倒混悬2~3次，1 500 r/min室温离心5 min，弃上清液。根据细胞数，加入1~2 ml FACS液，混悬，置冰上，避光，用BD FACSAriaTMⅡ流式细胞仪分选T细胞。
1.4.7 趋化实验实验各组用含1%BSA的RPMI 1640培养液100 μl重悬小鼠T细胞，以每孔5×104个细胞接种入于Transwell上室，下室中加入500 μl含1%BSA的RPMI 1640培养液，每种细胞均分为实验组和对照组，实验组下室趋化液含200 ng/ml CypA，对照组则不含CypA，5%CO2、37℃培养箱中孵育1 h，Giemsa染色，镜检，每组设3复孔，每孔显微镜下取4个随机视野计数。趋化活性以趋化指数（chemotaxis index, CI）表示，即每个实验组与对照组迁移到下室细胞数的比值。
1.4.8 C57Bl/6j小鼠皮下成瘤实验将约107Hepa1-6细胞或Hepa1-6-CD147shRNA细胞用0.25%胰酶消化3 min后，用0.9%氯化钠溶液吹打收集，1 200 r/min离心5 min，洗涤，重复二次，用1 ml注射器接种至C57Bl/6j小鼠腹股沟皮下，使其生长20天，每5天用游标卡尺测量肿瘤大小，并按公式V=1/2×（L×W2）计算肿瘤体积。
1.5 统计学方法采用SPSS Statistics17.0统计软件，用单因素方差分析（ANOVA）比较各组间的统计学差异，两组间比较用LSD法分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 小鼠肝癌细胞中CD147 mRNA的表达水平各组细胞的电泳条带图像经Gel-Pro Analyzer软件分析后计算灰度比值CD147/GAPDH。RT-PCR结果显示：转染pGPU6/GFP/Neo-CD147shRNA后，经G418筛选得到的单细胞克隆（shRNA-C）的CD147 mRNA水平显著低于其他组细胞，差异有统计学意义（P=0.000），Hepa1-6细胞与NC细胞的CD147 mRNA水平差异无统计学意义（P=0.281），见图 1。每组实验重复三次。
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| A: the expression of CD147 in the cells of each group detected by RT-PCR; B: the grayscale ratio of CD147 and GAPDH in the cells of each group; Hepa1-6: Hepa1-6 cells without transfection of CD147shRNA; NC: Hepa1-6 cells transfected with pGPU6/GFP/Neo vector containing nonsense sequence shRNA; shRNA-C: After the transfection of pGPU6/GFP/Neo-CD147shRNA, the single cell clone was obtained by G418 screening; *: P < 0.01, compared with Hepa1-6 (ANOVA) cells 图 1 RT-PCR检测各组细胞中CD147 mRNA的表达情况 Figure 1 Expression of CD147 mRNA in Hepa1-6, NC and shRNA-C cells detected by RT-PCR |
Western blot结果显示，转染pGPU6/GFP/Neo-CD147shRNA后，经G418筛选得到的单细胞克隆（shRNA-C）的CD147蛋白表达水平明显低于其他各组，见图 2。
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| A: the expression of CD147 in the cells of each group detected by Western blot; B: tthe grayscale ratio of CD147 and GAPDH in the cells of each group 图 2 Western blot检测各组细胞中CD147蛋白的表达情况 Figure 2 Expression of CD147 protein in Hepa1-6, NC and shRNA-C cells detected by Western blot |
各组细胞铺板后经120 h，相互比较各时间点吸光度值，差异均无统计学意义（P > 0.05），见图 3A；各组细胞加入不同浓度的CypA后，450 nm吸光度值的比较，其中当CypA浓度达到200 ng/ml和500 ng/ml时，Hepa1-6和NC组与shRNA-C组细胞比较差异有统计学意义（P < 0.01），见图 3B；不同浓度的CypA作用于细胞24 h后，对Hepa1-6组和NC组细胞有显著的促增殖作用，而对shRNA-C组细胞的促增殖作用不明显（P > 0.05），见图 3C。
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| A: the proliferation of Hepa1-6, NC and shRNA-C cells without CypA; B: the proliferation of the cells in each group after CypA administration, Hepa1-6, NC group were compared with shRNA-C group; C: the proliferation of the cells in each group after CypA administration, compared with 0ng/ml; ▲: P < 0.05, compared with shRNA-C group; ▲▲: P < 0.01, compared with shRNA-C group; *: P < 0.05, compared with 0ng/ml; **: P < 0.01, compared with 0ng/ml 图 3 CCK8法检测各组细胞增殖情况 Figure 3 Cells proliferation in each group detected by Cell Counting Kit-8 |
当Transwell下室中只加入200 ng/ml CypA（CypA）后，CI为2.62，与对照组（negative control）比较差异有统计学意义（P=0.000）；当CypA与Hepa1-6细胞共同位于下室（Hepa1-6+CypA）时，CI为1.13，CypA对小鼠T细胞的趋化作用显著性降低（P=0.000）；当CypA与shRNA-C组细胞共同位于下室（shRNA-C+CypA）或CypA与Hepa1-6细胞共同位于下室并加入CD147抗体（Hepa1-6+AntiCD147+CypA）时，CI分别为1.57和1.99，与“Hepa1-6+CypA”组比较差异有统计学意义（均P=0.000），见图 4。
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| *: P < 0.01, compared with Hepa1-6+CypA; ▲: P < 0.01, compared with negative control 图 4 Transwell小室法检测细胞趋化作用 Figure 4 T cells chemotaxis induced by CypA detected by Transwell chamber |
接种Hepa1-6细胞和shRNA-C细胞10天后，两组肿瘤体积比较差异有统计学意义（P=0.014），见图 5A；接种细胞20天后解剖小鼠取出肿瘤，可见Hepa1-6细胞的成瘤体积明显大于shRNA-C细胞的成瘤体积，见图 5B。
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| A: tumor size was measured on day 5, 10, 15, 20 and 25 after the injection and tumor volume was calculated as V=1/2×(L×W2); B: tumors were excised for gross comparision on day 20 after the injection 图 5 C57Bl/6j小鼠皮下成瘤实验 Figure 5 Subcutaneous tumor formation in c57bl/6j mice |
大量研究证实，CD147在正常组织细胞中弱表达或不表达，而在心血管疾病、阿尔茨海默病、免疫炎性反应，尤其是恶性肿瘤中呈高表达状态。现已检测出CD147在肝癌、肺癌、乳腺癌、头颈鳞癌、前列腺癌、黑色素瘤、胶质瘤、淋巴瘤等多种恶性肿瘤细胞中高表达，具有刺激基质细胞产生基质金属蛋白酶，导致细胞外基底膜降解、基质渗透以及促进肿瘤细胞侵袭和转移的作用[4-6]。CD147除在肿瘤细胞中高表达外，也普遍存在于免疫细胞的表面，在活化的T细胞、B细胞、树突状细胞、单核细胞和巨噬细胞中也呈高表达状态[10]，其对免疫细胞的成熟、活化和趋化至关重要。研究表明，CD147在肝癌细胞中明显上调，与肝癌的侵袭、转移、细胞增殖和代谢、抗凋亡及抵抗氧化应激机制密切相关[11-15]。Cyp的130多个成员[16]中，与CD147相互作用关系研究较多的是CypA和CypB，而这些研究大多是针对免疫炎性反应方面的[3]。CypA主要分布于胞质，是一种高度保守的蛋白，具有肽酰脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性，参与蛋白折叠、组装、胞内运输及信号转导等，具有分子伴侣的作用。血管平滑肌细胞在受到氧化应激后可分泌CypA，促进内皮细胞增殖[17]。对Cyp的研究虽大部分集中在细胞内，但越来越多的研究结果表明，Cyp在胞外也具有重要的功能。如CypA和CypB这两种Cyp家族中最丰富的成员，能够启动靶细胞的信号事件[3]。除CypA和CypB外，还没有证据证明Cyp家族中的其他成员能够被分泌到细胞外[3]，胞外存在这些蛋白质的原因是由于细胞死亡释放。CypB在人乳和血浆中均可被检测到，CypA则主要由于细胞受到炎性刺激和氧化应激时被分泌到细胞外。在动脉粥样硬化中，内皮细胞、单核细胞、血管平滑肌细胞及血小板可在过量的活性氧作用下分泌CypA至细胞外[18]。CypA也与T细胞等炎性细胞的功能相关，分泌型CypA能介导中性粒细胞、单核细胞及嗜酸粒细胞等炎性细胞的趋化[19]。研究表明，CypA与CDl47能以配体-受体的形式结合参与中性粒细胞、嗜酸粒细胞及T细胞的趋化[20-21]。
本研究首先检测细胞外CypA对不同CD147表达水平的小鼠肝癌细胞Hepa1-6增殖情况的影响，结果显示下调Hepa1-6细胞的CDl47水平后，显著降低了CypA对肿瘤细胞的促增殖作用，再次证明了CypA可通过与肿瘤细胞的CD147作用促进其增殖[22]。为了探讨CypA在不同CD147水平的肿瘤细胞的干预下，其趋化T细胞的能力是否会有变化，本研究利用Transwell小室法检测其趋化活性，结果显示，在加入Hepa1-6细胞后，CypA趋化T细胞的能力与加入Hepa1-6-CD147shRNA细胞相比，有显著降低，说明肿瘤细胞有可能利用其CD147抑制CypA趋化T细胞，进而逃避T细胞的免疫监视作用。本研究的体内实验显示Hepa1-6细胞在C57Bl/6j小鼠皮下的成瘤体积显著大于Hepa1-6-CD147shRNA细胞在C57Bl/6j小鼠皮下的成瘤体积，表明了在体内环境中CD147表达水平较高的肿瘤细胞的生存状况优于CD147表达水平较低的肿瘤细胞。这些实验结果可以证明在肿瘤细胞逃避T细胞的免疫监视过程中，CDl47参与了CypA对细胞生物学特性的影响，这即对已有的肿瘤细胞逃避T细胞免疫监视的理论作以补充，也为将其作为新的肿瘤治疗靶分子提供了更充实的理论依据。
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