0 引言

甲状腺激素受体（thyroid hormone receptor, TR）是一种配体依赖性转录因子，在哺乳动物组织中广泛分布，在转录水平调控靶基因的表达，对维持机体正常发育和代谢平衡具有重要作用^[1-2]。此前，在哺乳动物中已发现的多种不同的TR亚型，分别是由Trα和Trβ两个基因由于转录起始位点的不同或选择性剪接而产生的同功体，其中仅TRα1、TRβ1 、TRβ2 和TRβ3既可结合T3又可结合甲状腺激素DNA调控原件（thyroid hormone response elements, TREs）^[3]，被视为功能性受体。

近年来大量研究报告显示，Trβ还具有肿瘤抑制基因的功能^[4-5]，目前TRβ1作为肿瘤治疗的一个新的分子靶标备受关注^{[4, 6]}。而大鼠体内新发现的“加长型” TRβ同功体TRβΔ（GenBank登记注册，编号为DQ191165.1），与TRβ1高度同源，且研究已证实TRβΔ是功能性TR，具有转录因子的特性^[7]。为了探讨TrβΔ是否具有肿瘤抑制基因的功能，本研究以大鼠乳腺癌SHZ-88细胞为研究对象，探讨TRβΔ对SHZ-88细胞增殖、凋亡的影响及其可能机制。

1 材料与方法 1.1 细胞及试剂

大鼠乳腺癌SHZ-88细胞系购自中国科学院上海生命科学研究院；真核表达载体pcDNA3.1-TrβΔ、可磷酸化短肽（基序为“LLLRRRDNEY*FY*VRRLL”）均为前期构建保存；壳聚糖及T3（Sigma，美国）；胎牛血清（HyClone，南美）；RT-qPCR试剂盒（TaKaRa，日本）；BCA蛋白测定试剂盒（Pierce，美国）；细胞组蛋白/DNA碎片ELISA检测试剂盒（Roche, 德国）；Caspase-3/9分光光度法检测试剂盒及JC-1试剂盒（凯基生物科技发展有限公司，南京）；Annexin V-FITC凋亡试剂盒（Life, 美国）；CCK-8检测试剂盒（东仁化学科技有限公司，日本）；兔抗TRβΔ IgG由本实验室制备并保存；HRP标记的山羊抗兔IgG（博奥森生物技术有限公司, 北京）。

Caspase-3上游引物：5’-gAACggACCTgTggACCTg-3’，下游引物：5’- gggTgCggTAgAgTAAgC-3’，扩增产物长度214 bp；Caspase-9上游引物：5’-CACACCAgAAACACCCAg-3’，下游引物：5’-gCAgAAgTTCACgTTgTTg-3’，扩增产物长度154 bp；内参基因Gapdh上游引物：5’-ACAgCAACTCCCATTCTT-3’，下游引物：5’-TCCAgggTTTCTTACTCC-3’，扩增产物长度198 bp。上述引物均委托北京奥科生物技术有限公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 ^pSP-CS/pDNA复合物的制备

使用可磷酸化短肽(pSP)修饰壳聚糖形成^pSP-CS，并以^pSP-CS作为基因运输载体包被pcDNA3.1及重组质粒pcDNA3.1-TrβΔ形成^pSP-CS/pcDNA（^pSP-CS/pcDNA3.1和^pSP-CS/pcDNA3.1-TrβΔ）纳米粒复合物，具体方法见前报道^[8]。

1.2.2 Western blot印迹实验

^pSP-CS/pcDNA纳米复合物，瞬时转染SHZ-88细胞，48 h后裂解细胞提取核蛋白，进行SDS-PAGE。湿转法将凝胶中蛋白转至NC膜，室温封闭2 h，加入1:800稀释的兔抗TRβΔ IgG，4℃过夜后，加入1:5 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG，37℃ 2 h后进行曝光及显影，GAPDH作为内参。

1.2.3 细胞培养及转染

SHZ-88细胞培养于含10%FBS及双抗的1640培养液中，待细胞达85%~90%融合后，分别以5×10⁴、2.5×10⁵和1×10⁶/孔接种于96、24和6孔板中，生长至75%融合后进行转染，DNA用量分别为0.1、0.5和2.5微克每孔，实验分四组：pcDNA3.1（^pSP-CS/pcDNA3.1）、pcDNA3.1+T3（^pSP-CS/pcDNA3.1+T3）、pcDNA3.1-TrβΔ （^pSP-CS/pcDNA3.1-TrβΔ）及pcDNA3.1-TrβΔ+T3（^pSP-CS/pcDNA3.1-TrβΔ+T3）。其中T3组为转染pcDNA3.1和pcDNA3.1-TrβΔ后给予T3（10 nmol/L）干预，然后分别进行相关指标的检测。

1.2.4 CCK-8法检测细胞增殖

待上述接种于96孔板细胞转染48 h后, 每孔加入10 μl CCK-8溶液，设置空白调零组6孔（CCK溶液、培养液）。孵育3 h后，450 nm波长测定OD值，OD₄₅₀值经公式换算后，得出各组SHZ-88细胞增殖活力。

1.2.5 细胞凋亡及线粒体跨膜电位检测

待上述接种于6孔板细胞转染48 h后，收集4×10⁵个细胞，按照试剂盒说明进行Annexin V-FITC及碘化丙啶（PI）染色，流式细胞仪检测；收集细胞，按照ELISA试剂盒说明检测细胞组蛋白/DNA碎片，405 nm波长检测吸光度值并计算富集系数（反映各实验组相对于对照组核小体富集的程度, 即各实验组样品中细胞凋亡的相对水平）；收集细胞，JC-1染色后，流式细胞仪检测各组线粒体跨膜电位。

1.2.6 Caspase-9和Caspase-3

mRNA检测待上述接种于6孔板细胞转染48 h后，收集细胞提取总RNA，反转录生成cDNA。普通PCR扩增Caspase-9、Caspase-3及内参基因GAPDH，1.5%琼脂糖凝胶电泳初步鉴定PCR产物并行DNA序列分析。实时荧光定量PCR检测各cDNA样本，20 µl反应体系：SYBY Green Mix 10.0 µl、cDNA模板1.0 µl、上、下游引物（10 pmol/µl）各1.0 µl、灭菌双蒸水7.0 µl。反应条件： 95℃预变性30 s；95℃ 5 s、57℃ 20 s、72℃ 20 s，40个循环，每个循环延伸末检测荧光信号，计算各cDNA样本Caspase-9、Caspase-3及GAPDH的Ct值，Caspase-9、Caspase-3 的Ct值与相对应GAPDH的Ct值相减得到∆Ct进行标准化，以此来校正样本之间RNA的质量和反转录效率的差异，以2^-∆∆Ct计算得到Caspase-9、Caspase-3基因的相对表达水平。

1.2.7 Caspase-9、Caspase-3活性检测

待上述接种于6孔板细胞转染48 h后，收集5×10⁶细胞裂解，取上清测定蛋白浓度后，按照试剂盒说明检测405 nm波长吸光度值，通过计算OD_转染组/OD_{空白对照组}的倍数，确定各组Caspase-9、Caspase-3的活化程度。

1.3 统计学方法

应用SPSS17.0软件进行分析。计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，两两比较应用LSD法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Western blot印迹鉴定表达产物结果

SHZ-88细胞内存在TRβΔ少量基础表达，^pSP-CS/pcDNA纳米粒复合物可成功将TrβΔ转运进入SHZ-88细胞内并高效表达，见图 1。

2.2 TRβΔ抑制SHZ-88细胞增殖

与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-TrβΔ组SHZ-88细胞增殖活力下降（P=0.04），给予T3后抑制作用进一步加强（P=0.04），T3对pcDNA3.1组影响差异无统计学意义（P=0.86），见图 2。

2.3 TRβΔ促进SHZ-88细胞凋亡

流式细胞仪及组蛋白/DNA碎片定量检测结果均显示：与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-TrβΔ组对SHZ-88细胞凋亡有明显的促进作用（P=0.03），给予T3后促凋亡作用进一步加强（P=0.00）；T3对pcDNA3.1组影响差异无统计学意义（P=0.88），见图 3A。

2.4 TRβΔ降低SHZ-88细胞线粒体膜电位

无论T3存在与否，pcDNA3.1组主要为发射红色荧光的细胞，细胞膜电位较高，与pcDNA3.1+T3组比较，差异无统计学意义（P=0.57）；pcDNA3.1-TrβΔ转染后，发射红色荧光的细胞数减少，发射绿色荧光的细胞数增加，膜电位下降（P=0.00），T3作用后膜电位进一步下降（P=0.00），见图 4。

2.5 TRβΔ上调SHZ-88细胞中Caspase-9和Caspase-3 mRNA表达水平

定量PCR结果提示，与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-TrβΔ组明显上调Caspase-9和Caspase-3基因表达（P=0.02, P=0.02），给予T3后该作用进一步加强（P=0.02, P=0.00）；T3对pcDNA3.1组影响差异无统计学意义（P=0.72, P=0.71），见图 5。

2.6 TRβΔ 诱导SHZ-88细胞中Caspase的活化

与pcDNA3.1组相比，pcDNA3.1-TrβΔ组Caspase-9和Caspase-3活性明显升高（P=0.01, P=0.03），T3作用后活性进一步升高（P=0.01, P=0.01）；T3对pcDNA3.1组影响差异无统计学意义（P=0.46, P=0.89），见图 6。

3 讨论

TR除具有代谢调节作用外，近年被越来越多的研究证实还具有肿瘤发生调节作用，尤其是TRβ受体亚型表现出了明显的肿瘤抑制功能^[6-7]。在已发现的多种TRβ亚型中以TRβ1在体内的分布和生物学活性最为广泛，其在乳腺癌发生发展中的作用也越来越受到重视，而甲状腺激素及其受体与乳腺癌的发生发展长期存在矛盾性结论^[9]。有研究显示乳腺癌患者血清甲状腺激素T3水平升高^[10]，同时亦有研究显示乳腺癌患者血清T3水平下降^[11]，T3可促进乳腺癌细胞的凋亡^[12]，上述研究表明甲状腺激素在乳腺癌细胞生长中可能具有双向的作用。本研究显示，在TRβΔ过表达的乳腺癌SHZ-88细胞中，T3促进了乳腺癌细胞的凋亡。

大量研究显示在乳腺癌肿瘤组织中检测到了Trβ1基因突变、表达的降低甚至缺失^[13-14]，在乳腺癌细胞中转染Trβ1基因可有效抑制癌细胞的生长及转移^[15]。而大鼠体内新发现的TRβ同功体TRβΔ，与TRβ1高度同源，仅在DNA结合域（DNA-binding domain, DBD）比TRβ1多了36个氨基酸残基。前期研究已经证实TRβΔ是功能性TR, 具有转录因子的特性^[7]。TRβΔ是否与TRβ1相似同样对肿瘤细胞具有重要作用，本研究结果证实TRβΔ可有效抑制乳腺癌细胞的增长，并促进其发生凋亡。

细胞凋亡是一种独特的细胞死亡方式，是在基因调控下，由内外环境的改变或死亡信号触发引起的细胞程序性死亡。在凋亡细胞的胞质中出现核小体或寡聚核小体，通过ELISA可以对细胞凋亡进行定量检测。本研究中的ELISA及流式检测结果均显示TRβΔ明显促进SHZ-88细胞的凋亡。目前研究表明，调节细胞凋亡的途径主要分为三种：死亡受体途径、线粒体途径及内质网相关细胞凋亡途径，其中线粒体凋亡途径涉及线粒体膜电位的改变及Caspase-3, -9的活化等^[16]。线粒体受到凋亡信号刺激时，膜电位下降，膜通透性增加是细胞凋亡的早期特征。线粒体对JC-1的摄取依赖于跨膜电位，在膜电位正常的细胞，JC-1通过线粒体膜极性进入线粒体，浓度升高形成多聚体发射红色荧光；细胞凋亡时线粒体跨膜电位去极化，JC-1自线粒体内释出，浓度降低形成单体发射绿色荧光。通过检测红色和绿色荧光可以对线粒体膜电位的变化进行定量（细胞群荧光强度）和定性（细胞群偏移）检测。Caspase家族主要分为三大类：炎性反应介导因子、凋亡启动因子和凋亡执行因子，后两者在线粒体凋亡途径中起重要作用。凋亡启动因子包括Caspase-10、Caspase-9、Caspase-8等，能在其他蛋白辅助下活化并激活下游的凋亡执行因子Caspase-7、Caspase-6、Caspase-3等，其中的Caspase-3是Caspase家族中重要的凋亡执行者之一，是调控细胞凋亡的主要效应因子，其活化标志着凋亡进入不可逆性阶段。本研究结果显示，TRβΔ可降低线粒体膜电位，上调Caspase-3及Caspase-9基因表达同时促进Caspase-3及Caspase-9的活化，从而促进乳腺癌细胞的凋亡，且该作用明显受T3调控。这些表明TRβΔ可通过激活线粒体凋亡途径诱导乳腺癌SHZ-88细胞的凋亡。

综上所述，TRβΔ可抑制SHZ-88细胞的增殖并诱导其发生凋亡，为今后深入研究TRβΔ的肿瘤抑制功能提供了良好的实验基础。当然TRβΔ对肿瘤细胞的作用，可能还存在其他信号通路及各信号通路之间的复杂联系等，有待于我们今后重点研究。