0 引言

食管癌为世界第八大恶性肿瘤^[1]，在中国食管鳞癌死亡率占第四位^[2]，其5年的整体生存率约为10%^[3]。食管鳞癌的治疗目前以传统放化疗为主，然而多于40%的患者死于肿瘤的复发转移、化疗药物毒性反应以及放化疗引起的免疫性疾病^[4]。近年来，大量研究证实肿瘤组织中存在一小部分具有自我更新、多向分化潜能和致瘤能力强的肿瘤干细胞（CSCs），CSCs是恶性肿瘤的起源，促进肿瘤的生长、进展，并且对放化疗治疗手段有抵抗性，是肿瘤转移和复发的关键原因^[5]。目前低黏附成球培养和CSCs的特异性标志物可作为有效的分离、鉴别、富集CSCs的可靠方法^[6]，但是食管鳞癌肿瘤干细胞的表面标志物目前仍很少被证实，因此，寻找食管鳞癌的表面标志物具有重要指导意义。Lgr5又名GPR49，是一种G蛋白偶联受体，为Wnt信号通路的一个靶向基因，Barker等研究证实Lgr5为小肠正常干细胞的标志物，近来研究发现Lgr5在多种实体肿瘤中的表达也明显升高^[7-9], 但Lgr5在食管鳞癌中的表达及其临床意义鲜有报道。因此本研究检测Lgr5在食管鳞癌组织及食管鳞癌成球细胞中的表达变化，进而推测Lgr5在食管鳞癌中可能的干性作用。

1 资料与方法 1.1 资料和主要试剂

收集2012年1月—2014年12月在郑州大学第一附属医院胸外科行手术治疗的280例食管鳞癌患者的组织标本；男181例，女99例；年龄40~82岁，中位年龄61岁；肿块直径≤3 cm 62例，3~5 cm 70例， > 5 cm 148例；无淋巴结转移124例，淋巴结转移156例；浸润浅肌层73例，浸润深肌层99例，浸润全层108例；病理分级：高分化48例，中分化112例，低分化120例；按美国癌症联合委员会AJCC^[10]分期标准：Ⅰ+Ⅱ期105例，Ⅲ+Ⅳ期175例。所有食管鳞癌患者均为初诊患者，术前均未行放疗和化疗。另收集癌旁正常食管组织150例，取自上述食管鳞癌标本肿块边缘距离肿块5 cm或以上的正常食管黏膜组织标本，并均经病理证实无癌浸润；男87例，女63例，年龄42~78岁，中位年龄60岁。

Lgr5单克隆一抗购自美国Abcam公司；SP试剂盒、DAB试剂盒均购自北京博奥森生物技术有限公司；DMEM/F12购自美国HyClone公司；EGF、bFGF、B27生长因子均购自美国Gibco公司；TRIzol试剂购自美国Invitrogen公司；PCR引物由生工生物（上海）工程有限公司合成；cDNA试剂盒和RT-PCR检测相关试剂均购自日本TaKaRa公司；western裂解液、5×SDS蛋白上样缓冲液、SDS、PVDF膜均购自中国碧云天有限公司；Transwell小室购自美国FALCON公司；Matrigel胶购自美国Biolegend公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化学检测

将获得的石蜡切片进行烤片、脱蜡、水化；于0.01 mol/L柠檬酸钠缓冲修复液中微波热抗原修复；加3% H₂O₂室温反应30 min消除内源性过氧化物酶；滴加山羊血清封闭液室温封闭30 min；滴加1:200 Lgr5多克隆抗体，4℃反应过夜；次日滴加二抗，室温反应30 min；DAB显色，苏木精浅染细胞核；脱水透明，中性树胶封固，显微镜下观察染色结果。

免疫组织化学评分标准：在光学显微镜下，每张切片随机观察5~10个高倍（×400）视野，每个视野至少计数100个细胞，根据阳性细胞的细胞核或细胞质颗粒染色强度和阳性细胞所占百分率综合判断染色结果。按染色强度评分为：0分为无细胞染色；1分为染淡黄色颗粒或团块；2分为染棕黄色颗粒或团块；3分为染棕褐色颗粒或团块；按阳性细胞所占百分率评分：0分为阳性细胞百分率≤10%；1分为阳性细胞百分率达10%~50%；2分为阳性细胞百分率达＞50%~75%；3分为阳性细胞百分率＞75%；以上述2项分数的乘积对结果进行综合评分：0分为（－）、1~2分为（+）、3~4分为（++）、5~9分为（+++），其中≥（++）为高表达。

1.2.2 KYSE70成球细胞培养

食管鳞癌细胞KYSE70由本实验室保存。用含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培养液中培养，置于37℃、5%CO₂及100%湿度的培养箱中培养，当细胞融合为70%~80%时，用0.25%胰酶正常传代培养。取对数生长期细胞，消化吹打为单细胞悬液，进行细胞计数，低黏附6孔板每孔板接种细胞数量3×10⁴个/毫升，每孔加干细胞培养液（EGF（20 ng/ml）+bFGF（20 ng/ml）+B27（1:50）+DMEM/F12+肝素钠（4 μg/ml）+青链霉素混合液（100×））3 ml，在培养箱中培养，观察细胞球的形态变化。于2~3天半量换液，并于7天左右收集细胞球，800 r/min，离心5 min，轻轻吸弃上清液，加0.05%胰酶消化，加2~3 ml完全培养液中止胰酶消化，接种低黏附6孔板进行第二代培养。同时用0.05%胰酶消化后的单细胞悬液可用于后续的实验。

1.2.3 qRT-PCR检测KYSE70成球细胞Lgr5 mRNA的表达水平

实验分2组：KYSE70亲代细胞组和KYSE70成球细胞组。用TRIzol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA的浓度及纯度，运用cDNA试剂盒进行反转录反应：42℃、2 min去除基因组DNA反应，37℃、15 min，85℃、5 s反转录反应。以cDNA为模板，应用SYBR@Premix Ex Taq^TM Ⅱ进行PCR，先配制20 μl反应体系：上下游引物各4 μl，cDNA2 μl，SYBR@Premix Ex Taq^TM Ⅱ 10 μl；反应条件为：95℃预变性10 min；95℃ 10 s、60℃ 10 s、72℃ 10 s，40个循环；以GAPDH的表达水平作为内参照。Lgr5上游引物序列为5’-CCCTTCATTCAGTGCAGTGTT-3’，下游引物序列为5’-AGCAGGTGTTCAACAGGGTTT-3’；GAPDH上游引物序列为5’-TTGGTATCGTGGAAGGACTCA-3’，下游引物序列为5’-TGTCATCATATTTGGCAGGTT-3’。用2^-ΔΔCt法定量计算Lgr5 mRNA的相对表达水平。每组均设置3个复孔，计算平均值。实验独立重复3次。

1.2.4 Western blot检测KYSE70成球细胞Lgr5蛋白的表达水平

实验分2组：KYSE70亲代细胞组和KYSE70成球细胞组。均用蛋白裂解液裂解，提取细胞总蛋白，用BCA法测蛋白质浓度。进行10%SDS-PAGE以分离蛋白，电泳结束后将蛋白条带转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭后，分别加入Lgr5单克隆一抗和β-actin单克隆一抗（工作液体积稀释比例均为1:1000），4℃反应过夜；洗膜后加入二抗（工作液体积稀释比例为1:1000），室温反应1 h，洗膜后，ECL发光法显影、定影、曝光。采用Quantity One4.6.2软件对目的条带进行灰度值分析，以目的条带与内参β-actin条带的灰度值之比表示Lgr5蛋白的相对表达水平。每组实验均独立重复3次。

1.2.5 qRT-PCR、Western blot检测KYSE70成球细胞SOX2、ALDH1A1、NANOG mRNA和蛋白的表达水平

实验分2组：KYSE70亲代细胞组和KYSE70成球细胞组。按照1.2.3和1.2.4的方法，分别采用qRT-PCR、Western blot检测此三种干性基因在亲代细胞和成球细胞中的表达水平。每组实验均独立重复3次。

1.2.6 Transwell迁移侵袭实验检测KYSE70成球细胞的迁移侵袭能力

实验分2组：KYSE70亲代细胞组和KYSE70成球细胞组。Matrigel胶4℃冰中过夜溶解，在Transwell上室中加入50 μl Matrigel，37℃反应30 min。将2组细胞分别消化，中和，1 000 r/min，5 min离心，去上清液，PBS洗2遍，用无血清的1640培养液重悬，调整细胞密度，接种5×10⁴/100 μl的细胞至Transwell小室的上室，在下室加500 μl的含血清的培养液诱导其迁移，置于培养箱中15 h后，取出小室，用棉签擦去上层细胞，用4%多聚甲醛室温固定后用结晶紫染色5 min，置于光学显微镜下观察小室滤膜底附着的细胞数。每组随机选取5个视野（×200），技术每个视野穿过膜的细胞数，以此反映细胞的侵袭能力。每组实验均独立重复3次。

1.2.7 qRT-PCR检测KYSE70成球细胞中Vimentin、N-cadherin mRNA的表达水平

实验分2组：KYSE70亲代细胞组和KYSE70成球细胞组。实验方法同1.2.3。

1.3 统计学方法

本研究均采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，Lgr5在食管鳞癌、癌旁正常组织中表达的差异以及临床病理类型中的差异采用χ²检验；qRT-PCR、Western blot、Transwell实验均设两组比较，因此两独立样本之间的差异分析采用独立两样本t检验。均以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 食管鳞癌组织中Lgr5蛋白的表达

免疫组织化学检测结果显示，在食管鳞癌中，Lgr5的表达主要定位于细胞质、细胞膜，少数表达于细胞核；食管鳞癌组织中Lgr5蛋白的阳性表达率（67%）高于癌旁正常食管组织（35%），差异有统计学意义（χ²=19.285, P=0.000），见图 1、表 1。

2.2 食管鳞癌组织中Lgr5蛋白的表达与患者临床病理参数之间的关系

食管鳞癌组织中Lgr5蛋白的阳性表达率与患者的年龄、性别无明显相关性（P=0.390, P=0.348），与淋巴结转移、肿瘤大小、浸润深度、分化程度、肿瘤分期密切相关（均P < 0.05），淋巴结转移越多、肿块越大、肿瘤浸润程度越深、分化程度越低、分期越晚，Lgr5表达水平越高，见表 2。

2.3 低黏附培养食管鳞癌细胞KYSE70形成克隆细胞球的情况

食管鳞癌细胞系KYSE70用干细胞培养液通过低黏附6孔板悬浮培养，可形成细胞球，并且7天内不断增殖分化，其通过传代继续培养可以形成新一代的细胞球，并用胰酶消化为单细胞悬液，继续用RPMI 1640完全培养液培养，能继续贴壁正常生长，说明成球细胞具有自我更新和多向分化的能力，见图 2。

2.4 食管鳞癌KYSE70成球细胞和亲代细胞Lgr5 mRNA和蛋白的表达水平比较

qRT-PCR结果显示KYSE70成球细胞中Lgr5mRNA的表达水平较KYSE70亲代细胞明显升高，两者差异有统计学意义（P=0.016），见图 3。同样利用Western blot检测结果显示，KYSE70成球细胞中Lgr5蛋白的表达水平较KYSE70亲代细胞明显升高，差异具有统计学意义（P=0.007），见图 4。

2.5 食管鳞癌KYSE70成球细胞中干性相关基因SOX2、ALDH1A1、NANOG的表达水平

qRT-PCR和Western blot检测结果均显示KYSE70成球细胞中SOX2、ALDH1A1、NANOG的mRNA和蛋白表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（P=0.014, 0.009, 0.025），见图 5。

2.6 食管鳞癌KYSE70成球细胞与亲代细胞的迁移侵袭能力比较

Transwell迁移实验结果显示，成球细胞组和亲代细胞组平均穿膜细胞数为（120±6）个和（70±4）个；Transwell侵袭实验结果显示，成球细胞组和亲代细胞组平均穿膜细胞数为（46±4）个和（24±5）个；成球细胞组平均穿膜细胞数均较亲代细胞组明显增多，差异均有统计学意义（P=0.023, P=0.017），见图 6。

2.7 食管鳞癌KYSE70成球细胞与亲代细胞的Vimentin、N-cadherin mRNA表达水平比较

qRT-PCR结果显示，食管鳞癌KYSE70成球细胞的Vimentin、N-cadherin mRNA表达水平较亲代细胞明显升高，两者差异具有统计学意义（P=0.002, P=0.005），见图 7。说明干性较强的成球细胞中EMT相关的转移侵袭分子呈高表达水平。

3 讨论

肿瘤细胞中存在一小群具有干细胞样特性的细胞，对肿瘤的发生、进展、复发、转移有重要的影响，是导致放化疗失败的主要原因，最终导致患者不良预后^{[5, 11]}。CSCs在乳腺癌、结肠癌、胃癌、神经胶质瘤、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤等实体肿瘤中已被发现^[12-13]，在多种恶性肿瘤中，已通过肿瘤干细胞特异性标志物来鉴定和分离肿瘤干细胞，CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞具有自我更新、多向分化能力的干细胞样特性，100个CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞即可致裸鼠成瘤，研究同时证实CD44+CD24+ESA+胰腺癌细胞对化疗药物敏感度差，更易导致肿瘤的复发、转移，导致患者不良预后^[14]。同时也有部分表面标志物在正常干细胞和CSCs中同时表达，如Oct4、Nanog、CD133已在相关的正常以及肿瘤组织中得到证实^[15]。研究证实，低黏附成球培养利于肿瘤干细胞的富集，成球细胞表达相关的干性基因，如在胃癌干性的研究中，利用悬浮成球培养，mRNA、蛋白水平较普通亲代细胞增高，裸鼠成瘤能力增强等一系列相关实验证实CD44、CD133、Oct4、SOX2等干性相关基因都呈高表达水平^[15-18]。然而对食管鳞癌的低黏附成球培养的研究相对较少。因此，目前寻找食管鳞癌肿瘤干细胞标志物及富集肿瘤干细胞的研究至关重要，同时评价此肿瘤干细胞的诊断价值、探索其在食管鳞癌的复发、进展、转移中的功能也必不可少。

Lgr5又名GPR49，由18个富含亮氨酸的重复序列和7个跨膜区域组成，与促甲状腺激素受体、黄体激素受体和卵泡刺激素受体同源，都属于糖蛋白激素受体类^[19]。最初这一分子被发现的作用是调控特异胚胎组织的分化和增长。作为Wnt信号通路的一个靶基因，目前发现家族蛋白R-spondins为Lgr4、Lgr5的生理性配体, 结合后可强化Wnt/β-catenin信号通路，在胚胎及成体干细胞的自我更新以及结肠癌的发生方面发挥重要作用^[20]。Barker等研究者通过谱系追踪实验以及小肠干细胞的原代培养等相关实验证实单一Lgr5表达阳性的小肠干细胞可形成隐窝-绒毛类器官，进一步证实了Lgr5可作为小肠干细胞的特异性标志物^[7-9]。现有研究发现Lgr5广泛表达于骨骼肌、胎盘、脊髓、大脑、胃肠道、毛囊、眼睛、乳腺、生殖器等组织器官, 而且在结肠癌、乳腺癌、胃癌、宫颈癌、黑色素瘤、神经胶质瘤等肿瘤中高表达，其可能为这些实体肿瘤干细胞的表面标志物^[21-23]。目前有相关报道Lgr5在Barrett食管以及食管腺癌组织中表达水平增高，并且Lgr5表达水平越高的患者，生存预后越差^[24]。

本研究发现，与癌旁组织35%（52/150）相比，Lgr5蛋白表达水平明显高表达于食管鳞癌组织67%（188/280）；并且在有淋巴结转移、肿瘤浸润程度深、肿块较大、分化程度低的患者中Lgr5表达水平更高；在AJCC分期中Ⅲ+Ⅳ期者Lgr5阳性表达高于Ⅰ+Ⅱ期患者。这些结果都提示在食管鳞癌中Lgr5很大程度上与肿瘤的发生、进展、转移、以及不良的预后密切相关，Lgr5表达升高可能作为食管鳞癌进展、侵袭转移的一个标志之一，Lgr5表达较高的肿瘤细胞可能为肿瘤干细胞样细胞，这同肿瘤干细胞理论一致，在放化疗治疗后，因肿瘤干细胞的存在，以及其多向分化和自我更新的特征使得食管鳞癌更易复发、进展和转移，最终导致患者的不良预后。为更进一步了解Lgr5在食管鳞癌表达的意义以及研究其在食管鳞癌肿瘤干细胞样细胞中的表达情况，本研究采用低黏附无血清但含DMEM/F12培养液、EGF、bFGF、B27生长因子以及肝素的生长条件下，悬浮培养食管鳞癌细胞系KYSE70 7天，可以形成具有克隆及自我更新、多向分化能力具有干细胞样特性的成球细胞，通过qRT-PCR以及Western blot检测结果显示，Lgr5在食管鳞癌成球细胞中的mRNA水平及蛋白水平都较普通亲代细胞升高，并且在这些Lgr5表达水平较高的干细胞样成球细胞中干性相关基因表达水平也较高，同时成球细胞的侵袭迁移能力及上皮间质细胞的EMT相关标志物Vimentin、N-cadherin的mRNA表达水平均较亲代细胞高，同本研究前半部分免疫组织化学结果一致，Lgr5表达水平较高的食管鳞癌细胞更易导致肿瘤的复发、转移。

总之，Lgr5明显高表达于食管鳞癌组织及具有干细胞样特性的食管鳞癌成球细胞中，这反映Lgr5对食管鳞癌的发生、进展、转移、复发、耐药以及不良预后有重要影响，并且可能在食管鳞癌的干性调控中起重要作用，可成为治疗食管鳞癌患者特别是复发转移患者的一个新治疗靶点。