2016, Vol. 43文章信息
- 靶向沉默RNF2基因对食管癌细胞放射敏感度的影响
- Effect of Gene Silencing of RNF2 on Radiosensitivity of Esophageal Carcinoma Cells
- 肿瘤防治研究, 2016, 43(10): 829-834
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2016, 43(10): 829-834
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2016.10.002
- 收稿日期: 2015-09-18
- 修回日期: 2016-03-10
引用本文 |
2. 050011 石家庄，河北医科大学第四医院放 疗科;
3. 050011 石家庄，河北医科大学第四医院检验科
2. Department of Radiation Oncology, The Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China;
3. Department of Laboratory, The Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China
食管癌是一种常见的具有高发病率和死亡率的恶性肿瘤。据2014年世界癌症报告统计，食管癌发病率居恶性肿瘤第8位，死亡率居世界癌症的第6位[1]。放疗是治疗食管癌的重要方法之一，然而，放射线照射后引起的细胞损伤会产生细胞周期阻滞，为受损细胞的修复创造了条件，降低了放射线对肿瘤细胞的杀伤作用，是肿瘤细胞产生放射抵抗的重要原因[2]。RNF2基因作为多梳基因家族成员之一，在多种恶性肿瘤中高表达，如垂体腺瘤、胚胎性癌、胃癌、淋巴瘤、胰腺癌等[3-4]，并发现其在DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡等方面起着重要作用[5]。为了鉴定RNF2在调控放射损伤修复中的重要作用，本研究通过siRNA抑制RNF2的表达以观察其对食管癌ECA109细胞增殖和周期的影响，并检测了其对食管癌的放射增敏作用，为食管癌的临床治疗提供新的依据。
1 材料与方法 1.1 细胞系及主要试剂食管癌ECA109细胞为河北医科大学第四医院科研中心提供。小片段siRNA、脂质体转染试剂Lipofectamine RNAiMAX均为美国Invitrogen公司生产。兔抗人BMI-1单克隆抗体、单克隆抗体β-actin购自美国Abcam公司；碱性磷酸酶标记的IgG羊抗兔二抗为北京博奥森生物公司生产；BCIP/NBT底物显色试剂盒为美国Ameresco公司生产；TRIzol试剂购自美国Solarbio公司，氯仿、异丙醇、乙醇均购自北京化学试剂厂；反转录试剂盒购自美国Thermo公司。
1.2 细胞培养和照射细胞贴壁生长在玻璃培养瓶，加入含100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素以及10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养液，置5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，每2~3天传代一次。应用6-MVX线直线加速器照射ECA109食管癌细胞株，取机架角180°，源皮距100 cm，照射面积20 cm×20 cm，培养瓶下置0.5 cm组织补偿膜，室温下照射，照射剂量为6 Gy。
1.3 细胞转染当食管癌ECA109细胞贴壁生长达到80%~90%融合时，脂质体Lipofectamine RNAiMAX包裹小片段siRNA，转染ECA109细胞。细胞分为5组：control组、NC组、RNF2 siRNA1实验组、RNF2 siRNA2实验组、RNF2 siRNA3实验组。siRNA序列如下（只列出正义链）：RNF2 siRNA1：5'-GGUAACGCCACUGUUGAUCACUUAU-3'；RNF2 siRNA2：5'-CAGUGAGAAGCAGUAUACCAUUUAU-3'；RNF2 siRNA3：5'-CACAGUGAAUUAAUGUGCCCAAUUU-3'；NC组：5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'。转染24 h后收集细胞提取总RNA和蛋白，RT-PCR和Western blot法分别检测基因和蛋白表达，取干扰效果最佳序列的小片段siRNA进行后续实验。
1.4 RT-PCR检测由上海生工生物技术服务有限公司负责设计、合成引物，RNF2引物序列正义链为：5'-AGCACAATAATCAGCAAGCACTC-3'，反义链为：5'-GCTCCACTACCATTTTCAATCTG-3'，扩增大小112 bp。GAPDH基因引物序列：上游引物：5'-CGCTGAGTACGTCGT GGAGTC-3’，下游引物：5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTGTC-3’，拟扩增的片段长度为172 bp。PCR反应条件为：94℃ 5 min；然后94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 45s进行30个循环；72℃ 5 min；2%琼脂糖凝胶电泳，采用Genesys软件观察、拍照。
1.5 Western blot检测相关蛋白表达根据蛋白提取试剂盒说明提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，10%的SDS-PAGE分离，转膜、封闭，加入一抗RNF2（1:5 000稀释），4℃温度过夜，碱性磷酸酶标记IgG二抗（1:10 000）于37℃摇床温育1 h，TBST洗三次，每次5 min，然后Odyssey红外成象系统软件拍照，β-actin为内参。
1.6 MTT法检测转染对细胞增殖能力的影响取对数生长期的ECA109细胞，调整细胞浓度为5×104个每毫升。接种96孔培养板，100 μl每孔，37℃、5%CO2饱和湿度条件下过夜，次日转染沉默BMI-1的最佳干扰小片段RNA，并将转染空载体及未转染的ECA109作为阴性对照组（NC组）和空白对照组（control组），分别在照射后24、48和72 h收集细胞，MTT法检测各组细胞的增殖活性，每组设3个复孔。
1.7 细胞克隆形成实验检测细胞放射敏感度取对数生长期的各组细胞，消化后计数，稀释后得到不同浓度的细胞。根据不同细胞数目给予不同的照射剂量。细胞个数分别为200、400、600、1 000、5 000个，相应照射剂量分别为0、2、4、6、8 Gy，每组照射剂量设3个平行孔。照射后培养14天，甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下计数≥50个细胞数的克隆数，计算克隆形成率。计算公式：接种效率（plating efficiency, PE）=对照组克隆数/细胞接种数×100%，存活分数（surviving fraction, SF）=实验组克隆数/（细胞接种数×PE）。实验重复3次。在Graph Pad Prism 5.0软件中，使用单击多靶模型计算放射生物学参数并拟合剂量存活曲线。
1.8 流式细胞术分析各组照射前、后食管癌细胞周期和凋亡的变化取上述各组细胞在照射后24 h收集，用PBS洗涤3遍，并重新悬浮于预冷的70%乙醇中，4℃固定2 h；离心弃固定液，用PBS悬浮细胞5 min后于300目筛网过滤；加入PI（propidium iodide）染液，室温反应10 min，4℃避光染色30 min，用流式细胞仪（Beckman）应用Single histogram statistic分析软件测定各实验组食管癌细胞周期的变化。
收集照射后24 h的ECA109食管癌细胞，用PBS洗涤3遍，弃上清液，加100 μl 1×缓冲液，再加入Annexin V 2.5 μl，4℃静置5 min；加入PI 10 μl，4℃静置5 min，然后加入1×缓冲液400 μl，轻晃混匀，上机检测各实验组食管癌细胞的凋亡分布。
1.9 统计学方法所有数据采用SPSS13.0统计学软件进行统计分析，实验结果以（x±s）表示，组间比较用重复测量设计资料方差分析，P < 0.05判定为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 食管癌细胞株ECA109转染前、后RNF2 mRNA和蛋白的表达分别提取瞬时转染的siRNA组（RNF2 siRNA1、RNF2 siRNA2、RNF2 siRNA3）和NC组、control组细胞总RNA和蛋白，对各组RNF2基因和蛋白进行检测。RT-PCR结果发现，3对靶向siRNA序列组的RNF2 mRNA相对表达量较control组均有不同程度的下降，尤以RNF2 siRNA1和siRNA2组下降最为明显（均P=0.000），NC组和control组之间RNF2 mRNA的相对表达量的差异无统计学意义（P=0.759），见图 1。同时，Western blot检测结果显示，与control组相比，siRNA1~3组的RNF2蛋白表达的干扰效率分别为75.48%（0.193±0.029 vs. 0.787±0.084）、61.37%（0.304±0.037 vs. 0.787±0.084）、16.26%（0.659±0.047 vs. 0.787±0.084），RNF2 siRNA1、siRNA2与control组、NC组相比，差异有统计学意义，且RNF2 siRNA1下降的更明显（均P=0.000）；NC组与control组相比（0.792±0.075 vs. 0.787±0.084），差异未见统计学意义（P=0.790），见图 2。
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| 1: control group; 2: NC group; 3: siRNA1 group; 4: siRNA2 group; 5: siRNA3 group; **: P < 0.01, compared with control group or NC group 图 1 RT-PCR检测转染后各组细胞中RNF2 mRNA的表达 Figure 1 mRNA expression of RNF2 after transient transfection detected by RT-PCR |
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| 1: control group; 2: NC group; 3: siRNA1 group; 4: siRNA2 group; 5: siRNA3 group; **: P < 0.01, compared with control group or NC group 图 2 Western blot检测转染后各组细胞中RNF2蛋白的表达 Figure 2 Protein expression of RNF2 after transient transfection detected by Western blot |
与NC组相比，RNF2 siRNA组中细胞的增殖水平在照射后24、48、72 h明显降低（均P=0.000），而control组与NC组细胞比较，差异无统计学意义（P=0.339, P=0.961, P=0.214），见图 3。此外，未照射时，NC组与RNF2 siRNA组相应的24、48、72 h比较，差异未见统计学意义（P=0.539, P=0.345, P=0.937），提示基因RNF2转染对食管癌细胞的增殖未见明显影响。并且control组、NC组、RNF2 siRNA组分别在照射后48 h（P=0.000, P=0.000, P=0.015）和72 h（P=0.000, P=0.000, P=0.018）增殖水平明显高于其相应照射前水平，而三组分别在照射后24 h增殖水平与照射前没有明显差异（P=0.925, P=0.695, P=0.124）。
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| A: the proliferation activity of cells before irradiation; B: the proliferation activity of cells after irradiation; **: P < 0.01, compared with control group or NC group; ▲: P < 0.05, compared with the proliferation activity of cells before irradiation 图 3 照射前后食管癌细胞株ECA109在不同时间的增殖水平 Figure 3 Proliferation activity of ECA109 cells in different groups before and after irradiation detected by MTT assay |
克隆形成实验结果显示control组、NC组、RNF2 siRNA组的D0值分别为2.45、2.43、1.70 Gy；Dq值分别为3.03、2.93、2.43 Gy；外推数N值分别为3.444、3.300、4.174；SF2值分别为0.8662、0.8512、0.7654。由此得出，control组和NC组放射敏感度未见明显差异，而RNF2 siRNA组的放射敏感度显著高于control组和NC组，见图 4。
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| 图 4 克隆形成实验检测BMI-1对细胞增殖的影响 Figure 4 Effect of BMI-1 on cells proliferation measured by clone conformal assay after irradiation |
照射后24 h，control组、NC组、RNF2 siRNA组细胞中G0/G1期的比例均较未照射组升高，差异具有统计学意义（P=0.005, P=0.002, P=0.000），且RNF2 siRNA组比control组和NC组G0/G1期比例升高的更明显，差异有统计学意义（均P=0.000）；而照射后RNF2 siRNA组S期比例明显低于control组和NC组（均P=0.000），且control组、NC组和RNF2 siRNA组S期比例均分别低于相应未照射组（均P=0.000）；照射前后各组处于G2/M期的细胞比例未见显著性差异（P=0.309, P=0.845, P=0.945），见图 5、表 1。
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| 图 5 流式细胞术检测照射前(A)、后(B) BMI-1对细胞周期的影响 Figure 5 Effect of BMI-1 on cell cycle detected by flow cytometry before (A) and after (B) irradiation |
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流式细胞术检测结果显示，6 Gy放射线照射后control组、NC组、RNF2 siRNA组ECA109细胞凋亡率均分别高于相应未照射组（P=0.001, P=0.001, P=0.000），而照射前，RNF2 siRNA组细胞凋亡率较control组和NC组高，但差异未见统计学意义（P=0.198, P=0.104）；照射后，RNF2 siRNA组细胞凋亡率明显高于control组、NC组，且差异具有统计学意义（均P=0.000），见图 6。
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| A: the distribution of cells apoptosis before irradiation; B: the distribution of cells apoptosis after irradiation; C: corresponding histogram of apoptosis rate; **: P < 0.01 compared with control or NC group; ▲▲: P < 0.01, compared with no irradiation 图 6 照射前、后食管癌ECA109细胞株凋亡分布 Figure 6 Distribution of cells apoptosis in ECA109 cells before and after irradiation |
RNF2蛋白是一个带有指环结构的泛素连接酶（E3），是一种转录抑制蛋白，属于多梳基因家族（polycomb group, PcG）成员，由336个氨基酸组成，在多种肿瘤中高表达，与基因转录、肿瘤生长、侵袭、迁移等方面关系密切[4, 6]。RNF2基因的突变和失活致使细胞基因不稳定、DNA双链断裂修复受损，出现对放射线的高度敏感，因此抑制肿瘤细胞内RNF2蛋白的表达可显著增加肿瘤细胞对放射治疗的敏感度，增加放射治疗的疗效[7]。此外，DNA损伤后，RNF2可被招募到损伤部位，从而为损伤修复创造条件[8-9]。本实验通过利用RNA干扰技术降低人食管癌细胞中RNF2的表达，联合X线照射，进一步研究RNF2基因与食管癌细胞放射敏感度的关系。
本研究针对RNF2基因的不同位点设计合成了3对siRNA序列，通过RT-PCR和Western blot检测食管癌细胞中RNF2在mRNA和蛋白水平的表达，结果发现3对干扰序列对RNF2的表达均有不同程度的抑制作用，尤其是siRNA1抑制作用更加明显，此外本研究中MTT结果显示照射前control组、NC组和干扰组细胞的增殖能力无明显差异，说明采用的转染方法安全可靠。然而，照射后干扰组细胞的增殖水平显著低于control组和NC组，表明RNF2基因干扰联合X线照射可有效抑制细胞的生长。本实验结果与Chen等[10]在胰腺癌中的研究相似，抑制基因RNF2的表达可显著降低胰腺癌细胞增殖和肿瘤体积的增长。
为了检测转染后对肿瘤细胞放射敏感度的影响，本研究采用了克隆形成实验来验证食管癌细胞的存活能力，结果发现干扰组细胞的Dq值明显小于control组和NC组的Dq值，Dq值表示细胞对亚致死损伤修复能力大小，Dq值越小，表明细胞的亚致死损伤修复能力越弱，放射线对细胞的杀伤力越大；SF2指肿瘤细胞经2 Gy照射后的细胞存活分数，是评价肿瘤细胞内在放射敏感度的重要指标，本研究中干扰组细胞的SF2明显低于control组和NC组，表明干扰RNF2的表达后显著增加了肿瘤细胞的放射敏感度。本实验结果与国外学者Zhou等[7]在神经胶质瘤中的研究一致，敲低RNF2基因的表达可明显提高神经胶质瘤细胞U87对X射线的放射敏感度。
细胞的放射敏感度与细胞周期和凋亡的关系密切，细胞周期阻滞在照射后DNA损伤修复中起重要作用，为照射后DNA损伤修复创造条件，有效地抑制了放射线对细胞的杀伤作用，从而为降低放射敏感度提供了可能[11-12]。有研究发现RNF2的高表达会引起S期增加，而敲低RNF2表达会诱导肺癌细胞G1期比例增加，S期降低[5]，在脑胶质瘤细胞中也有类似报道[7]。本研究中结果与上述报道相似，X线照射后干扰组细胞G0/G1期比例显著高于control组和NC组，S期比例明显降低，提示干扰RNF2的表达在一定程度上诱导了周期阻滞在G0/G1期，抑制了细胞周期向S期过渡，阻止了细胞生长，促进了放射线对细胞的杀伤力，增加了细胞凋亡，从而提高了食管癌细胞的放射敏感度。有研究表明，X射线照射后，DNA双链发生断裂，泛素化连接酶RNF2首先诱导组蛋白H2AX发生泛素化，泛素化的H2AX易被活化的ATM激酶磷酸化形成γ-H2AX，从而促使下游基因MDC1和53BP1聚集到DNA双链断裂处，感应和放大损伤信号，进而影响细胞增殖水平和周期分布；下调RNF2基因表达后，H2AX磷酸化水平明显受抑，其接受损伤信号的能力下降，不能及时向下游传递损伤信号，细胞生长缓慢、周期阻滞功能受损，下游基因损伤修复能力下降，进而诱导细胞凋亡的发生，从而增强了放射敏感度[13-14]。并且本研究中抑制RNF2基因的表达后，细胞的凋亡显著增加，与Wen等[15]在结肠癌中的报道一致。此外，为进一步探讨RNF2基因对食管癌放射增敏的作用机制，我们在前期研究中发现，RNF2蛋白与γ-H2AX蛋白之间存在时间和剂量依赖性，且敲低RNF2基因后，γ-H2AX蛋白的表达显著降低，这表明RNF2基因可能通过调控γ-H2AX蛋白的表达，从而在食管癌放射损伤修复中发挥作用[16]。
综上所述，本研究结果证实，RNA干扰技术抑制RNF2基因表达后，联合X线照射可有效地抑制细胞增殖水平，且通过诱导G0/G1期阻滞增强了食管癌细胞对电离辐射的放射敏感度，为食管癌的放射治疗和基因治疗提供理论研究。RNF2基因沉默和放疗的联合应用将有助于改善食管癌患者的长期生存，对食管癌的临床应用具有重大意义。
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