0 引言

肿瘤对人类健康造成巨大威胁，如何实现真正意义上的靶向治疗是攻克肿瘤的重要策略。近年研究发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一类来源广泛、具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，其最大特点是能够被招募至组织损伤或炎性反应部位^[1]，而肿瘤组织因为有着类似的炎性反应环境也可以募集MSCs前来，这一特点使MSCs成为目前体内携带抗肿瘤药物及基因到达肿瘤部位实现靶向治疗目标的重要载体之一^[2-4]。临床治疗过程中我们发现，化疗引起肿瘤细胞损伤形成慢性炎性环境后，间充质细胞在肿瘤组织内的聚集明显增多^[1]。目前MSCs向肿瘤炎性反应部位归巢的机制尚不清楚，其中趋化因子与受体间的相互作用被认为在此过程中发挥了至关重要的作用^[5]。本研究进一步探讨化疗参与肿瘤细胞表面趋化因子受体水平的调节，进而影响MSCs的归巢。为常规化疗与细胞治疗联合应用提供重要理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料

人脐带间充质干细胞（human ambilical cord mesenchymal stem cells,HUMSCs）（分离自辽宁中医药大学附属医院妇产科新生儿脐带组织），阿霉素（ADR）与5-Fu（国产购自辽宁中医药大学附属医院门诊药房），CCK-8 kit（购自日本同仁公司），Transwell小室（购自美国corning公司），Real-time PCR试剂（购自美国ABI公司），RIPA裂解液（购自上海碧云天公司），抗CD105抗体（购自美国BD Pharmingen公司），抗鼠FITC标记的荧光二抗（购自美国eBiosciene公司），CCR6-PE（购自美国eBiosciene公司），CXCR4-PerCP（购自美国BD Pharmingen公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUMSCs的分离及扩增

本实验所使用MSCs来源于人脐带组织，术中取下的脐带在24 h内进行处理，具体分离过程如下：脐带用含双抗的PBS冲洗，剪成1 cm长的小块，冲洗。剥离脐带动静脉血管壁，取胶冻状的华通氏胶部分，剪碎至0.5 cm³小组织块，依次摆放于预先润湿的T-75 cm塑料培养瓶中倒置培养。4~8 h后翻转培养瓶，次日添加含1 ml 10% FCS及2 mmol L-谷氨酰胺的DF-12培养液，连续添加3天，每次1 ml，第4天全量换液，以后每周换液2次。分离10~14天后，去除组织块，用含0.125%胰酶和0.01%EDTA的细胞消化液消化细胞，进行初次原瓶传代（P1），待细胞长至60%~70%融合时，二次传代（3 000 /cm2）或冻存。取培养至3~5代HUMSCs细胞用于实验。

1.2.2 CCK-8细胞生长抑制实验

取1.2×10⁵每毫升的HepG2或MCF-7细胞，接种于96孔培养板中，每孔90 μl培养液，然后加入10 μl不同浓度的5-Fu或ADR，对照组加10 μl 0.9%氯化钠溶液，继续培养48 h，再向每孔加入10 μl CCK-8试剂，37℃培养箱中继续孵育2 h，于酶标仪上测定450 nm的吸光度值，利用Graphpad prism5软件计算IC₅₀值。

1.2.3 Transwell法检测HUMSCs向受损肿瘤细胞的迁移作用

取对数生长期细胞，计数后用含5% FCS的DMEM培养液调整HepG2细胞密度为1×10⁴每毫升，接种于24孔板中，0.5毫升/孔，加入不同浓度的ADR与5-Fu，放入37℃、5%CO₂培养箱内培养36 h，取细胞培养上清液500 μl加入24孔板中。次日，小心轻柔的将Transwell小室放入已含培养上清液的24孔板中，于细胞培养箱预平衡1 h。消化收集并调整 < /span>HUMSCs细胞密度为1×10⁵每毫升，各取400 μl细胞悬液小心加入预平衡的Transwell小室内，37℃、5%CO₂细胞培养箱培养4 h。取出小室，室温风干；24 孔板中加入0.1%结晶紫溶液500 μl，将小室置于其中，37℃染色45 min；染色结束后PBS漂洗3~4次直至液体澄清，用棉签轻轻拭去小室上面的HUMSCs，倒置、风干；倒置显微镜下随机选取5个20倍物镜视野计数染色细胞数目。

取对数生长期的细胞，计数后用含5% FCS的PRIM1640培养液调整MCF-7细胞密度为2×10⁵每毫升，接种于24孔板中，0.4毫升/孔，加入不同浓度的ADR和5-Fu，连续培养36 h后，小心轻柔的将Transwell小室放入已含细胞的24孔板中，消化收集并调整HUMSCs细胞密度为1×10⁵每毫升，各取400 μl细胞悬液小心加入预平衡的Transwell小室内，37℃、5%CO₂细胞培养箱培养4 h。分析方法同上。

1.2.4 Real-time PCR检测相关趋化因子的基因表达水平

取对数生长期细胞，计数后用含5%FCS的DMEM培养液调整HepG2或MCF-7细胞密度为1×10⁶每毫升，接种于6孔板中，0.5毫升/孔，放入37℃、5%CO₂培养箱内，次日加入IC₂₀和IC₅₀浓度的ADR或5-Fu连续培养36 h，收集上述各组细胞，冷PBS洗涤一次，计数后转移至1.5 ml EP管中，提取细胞总RNA，反转为cDNA，采用Bio-Rad iQ?5或ABI7500进行测定。反应结束后，设定阈值，输出Ct值。根据比较Ct值法公式2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt=（Ct目的基因-Ct管家基因）_实验组-（Ct目的基因-Ct管家基因）_对照组，获得不同组间相关基因表达的比值。Real-time PCR反应条件为：95℃变性15 s，60℃复性1 min，95℃再变性15 s；应用7500 System Software进行数据分析。

CCR6引物：上游：5’-CAGGAGGTCAGGCAGTTCTCCA-3’，下游：5’-CTCAAGCCCCAACATCAGCAGC-3’；CXCR4引物：上游：5’-TTCTACCCCAATGACTTGTG-3’，下游：5’-ATGTAGTAAGGCAGCCAACA-3’；GAPDH引物：上游：5’-CCAGCCGAGCCACATCGCTC-3’，下游：5’-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’。

1.2.5 Western blot检测趋化因子受体基因的蛋白表达水平

按照上述处理方法处理HepG2或MCF-7细胞，收集细胞，PBS洗后加入适量预冷的RIPA裂解液（2×10⁷细胞中加入500 μl裂解液），混匀后冰上放置30 min，并缓慢晃动，超声碎细胞后4℃，12 000 r/min离心15 min，收集上清液备用或-80℃保存，避免反复冻融。BCA蛋白定量后每孔上样200 ng。SDS-PAGE后分别用CCR6、CXCR4一抗和HRP标记羊抗鼠二抗进行杂交。

1.2.6 免疫组织化学法检测体内HUMSCs向肿瘤部位的趋化能力

4周龄雌性裸鼠右上肢皮下接种MCF-7肿瘤细胞2周后，开始尾静脉连续隔天给ADR[2 mg/(kg.d)]，2周后尾静脉注射HUMSCs，3天后取肿瘤组织，放入10%福尔马林固定液中固定48 h后，石蜡切片，脱蜡，梯度酒精水化至蒸馏水，PBS冲洗5 min，共3次，微波炉抗原热修复，PBST冲洗5 min，滴加50 μl羊血清工作液封闭，滴加一抗工作液（鼠源抗人CD105抗体），FITC荧光标记二抗工作液，DAPI（1 μg/ml）复染细胞核，5 min，避光孵育，甘油封片，共聚焦显微镜观察并照相。

1.3 统计学方法

采用GraphPad Prism5软件进行组间方差分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CCK-8法检测细胞生长抑制实验

CCK-8细胞增殖抑制实验表明，化疗药物ADR与5-Fu对不同来源的肿瘤细胞均具有明显杀伤作用。其中ADR处理HepG2和 MCF-7细胞的IC₅₀值分别为（8.7±0.08）μmol/L和（3.45±0.17）μmol/L；5-Fu处理HepG2 和MCF-7细胞的IC₅₀值分别为（8.45±0.98）μg/ml 和（4.52±0.15）μg/ml，见图 1。

2.2 Transwell验证HUMSCs向受损肿瘤细胞的迁移能力

HepG2细胞培养上清液对HUMSCs细胞趋化作用的研究结果表明，IC₂₀的ADR或5-Fu处理后，HepG2细胞培养上清液对HUMSCs的趋化作用均较空白对照组显著增加（P=0.017,P=0.030）。IC₅₀浓度的5-Fu处理细胞后，HepG2细胞培养上清液对HUMSC的趋化作用较空白对照组、IC₂₀组明显提高，但IC₅₀浓度的ADR处理细胞后，HepG2细胞培养上清液对HUMSC并未出现明显趋化作用，显微镜下观察可见细胞胞体变大，提示过高浓度的化疗对于细胞稳定状态的维持不利，不适用于联合化疗，见图 2。

MCF-7细胞经IC₂₀或IC₅₀的ADR或5-Fu处理后与HUMSCs细胞进行共培养实验，结果表明，无论高浓度还是低浓度的药物处理后，肿瘤细胞均可以增强其对HUMSCs的趋化作用，该作用具有化疗药物的剂量依赖性，其中IC₅₀浓度的ADR和5-Fu化疗药物处理组与对照组差异均有统计学意义（P=0.008,P=0.001），见图 3。

2.3 Real-time PCR验证趋化因子受体水平

IC₂₀和IC₅₀浓度的ADR与5-Fu处理36 h后，HepG2细胞表面CCR6分子的基因表达水平增高4~5倍，MCF-7细胞表面CXCR4分子的基因表达水平增高5~7倍，IC₂₀、IC₅₀处理组与对照组相比，差异均有统计学意义，见图 4。

2.4 Western blot检测肿瘤细胞表面趋化因子受体表达水平

IC₂₀和IC₅₀浓度的ADR与5-Fu处理HepG2和MCF-7细胞36 h后，HepG2细胞表面的CCR6分子表达水平和MCF-7细胞表面的CXCR4表达分子水平均明显增高，具有剂量依赖性，见图 5。

2.5 免疫组织化学法显示受损部位的HUMSCs聚集增加

裸鼠皮下接种肿瘤细胞后成瘤，其中一组老鼠给予化疗药物治疗后尾静脉输入HUMSCs，另一组老鼠直接尾静脉输入HUMSCs，3天后取肿瘤组织制备石蜡切片，免疫组织化学结果显示给予化疗药物治疗的肿瘤组织中慢性炎性反应浸润明显，HUMSCs浸润程度明显高于未经化疗药处理的对照组，见图 6。

3 讨论

靶向清除肿瘤细胞或肿瘤干细胞能够有效治疗肿瘤。多年来，人们一直困扰于寻找不到肿瘤特异性标志物、无法实现靶向肿瘤的目标。直到近年，间充质干细胞被发现能向体内炎性反应部位趋化、同时能够很好的归巢至多种肿瘤部位并释放治疗基因，逐渐成为治疗恶性肿瘤的研究热点之一。

在临床化疗过程中发现接受过化疗的肿瘤患者的病理切片常见MSCs聚集增多^[1]。这一发现对于利用MSCs作为体内药物载体靶向治疗肿瘤具有重要意义。

MSCs是一类广泛分布于全身多种组织，如骨髓、脂肪组织、肝脏、胎盘、脐带血、脐带组织等^{[3, 6-7]}、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的细胞^[8]。MSCs最大的特点是能够特异地向肿瘤部位归巢^[1]，可将抗肿瘤药物如细胞因子、凋亡诱导剂、干扰素、前药等运送至肿瘤部位从而抑制肿瘤生长^[8-9]，MSCs分离纯化方便、可在体外进行大量扩增，比较方便地进行基因改造，具有低免疫原性以及免疫调节等方面的特性^[10-11]。

现有用于治疗的间充质干细胞来源广泛^{[12, 13, 14-15]}，但不同研究显示MSCs在用于肿瘤治疗时往往表现出截然不同的作用，在肺癌等恶性肿瘤中表现为促肿瘤生长作用，在白血病等肿瘤中表现为抑制肿瘤生长作用^[16-17]，给MSCs应用的安全性带来极大的隐患。作为肿瘤微环境的一部分，MSCs可通过趋化因子作用引起肿瘤细胞表型的可逆性变化，促进肿瘤恶性行为。经体外实验证实，CCL5参与人MSCs促进骨肉瘤Saos-2细胞增殖能力的增强^[18]。肿瘤微环境刺激MSCs表达IL-6和EGF进一步促进了卵巢癌细胞Skov-3的生长^[19]。CXCL12可以通过自分泌或旁分泌的形式诱导肿瘤细胞增殖。本研究在大量查阅文献基础上，选择了HUMSCs作为研究对象，HUMSCs是目前尚未见报道参与肿瘤增殖的一种间充质干 细 胞。其来源更方便、增殖速度较快、无致瘤性、且无伦理学争议^{[6, 9, 15]}。近年HUMSC的肿瘤归巢能力也已经得到明确证实，尾静脉注射HUMSCs 24 h后，即可以在肿瘤局部观察到HUMSCs的聚集^[20]。

目前参与间充质干细胞归巢的调节因子仍不完全清楚，趋化因子被认为在其中发挥了关键作用。CXC趋化因子受体4（CXCR4）是最主要的趋化因子受体之一，在多种类型细胞中均有表达，包括淋巴细胞、造血干细胞、内皮细胞和肿瘤细胞。CXCR4与其配体—基质细胞衍生因子1（SDF-1，也称CXCL12）结合，能介导多种与细胞趋化、细胞存活或增殖相关信号转导通路。

此外，其他多种趋化因子也与肿瘤的发生发展关系密切。Yamauchi等^[21]发现CCR6、O’Hayre等^[22]发现CCR7在人肝癌细胞HepG2中表达增加，Rubie^[23]也发现11例手术切除的肝癌组织中CCR6与CCL20的表达明显高于正常肝组织，并且与患者分期较晚成正相关。Müller等^[24]发现人乳腺癌细胞系、乳腺癌原发灶及转移灶高表达趋化因子受体CXCR4和CCR7，乳腺癌最常见的淋巴结、肺、肝脏和骨髓等转移灶含较高水平的CXCL12和CCL21。

发育过程中趋化因子和受体的广泛表达为体外趋化因子-受体的相互作用提供了重要信息。趋化因子及其受体的组织分布特征以及它们相互作用在白细胞迁移中的作用也已被大量研究。Luttichaux等^[19]发现，尽管只有小部分骨髓间充质干细胞（BMSC）表达CCR1和CCR7，但配体CCL3、CCL19和CCL21还是能直接诱导BMSC迁移。本研究观察到中低浓度的化疗药处理肿瘤细胞后，其培养上清液或细胞本身均能直接或间接引起HUMSCs迁移的增多。提示化疗药很可能作用于MSCs归巢相关分子，进而影响其向肿瘤细胞的迁移。进一步，本研究采用中低浓度的常规化疗药处理细胞，发现HepG2细胞表面CCR6和MCF-7细胞表面CXCR4受体分子的基因和蛋白表达水平明显提高。IC₂₀浓度化疗药处理后的效果最为稳定，无论是细胞培养上清还是 细 胞直接接触均可以引起HUMSCs向肿瘤细胞趋化的增加，而IC₅₀浓度的化疗药由于会造成肿瘤细胞不同程度的出现早期凋亡现象，进而影响细胞内相关分子的表达，因此在联合常规化疗与间充质干细胞治疗的过程中推荐采用IC₅₀浓度以下的剂量对于提高间充质细胞的归巢效果更好，同时借助归巢的MSCs携带治疗基因实现对肿瘤细胞的局部杀伤，可以更大程度地减少非特异的损伤和不良作用。

对于应用MSCs的细胞治疗手段来说，MSCs特异性地向受损肿瘤部位的迁移增加是提高MSCs运载能力的关键步骤，同时，越来越多的研究支持，单一治疗方式并不能有效缓解肿瘤，多种疗法联合才是未来的发展趋势，其中化疗因其杀伤效果明显、短期抑制肿瘤生长、缓解病情而被认为仍是目前有效的肿瘤治疗手段之一，因此利用常规化疗加强MSCs归巢的生物治疗方法可能会因此大大受益，携带更多的抗肿瘤药物到肿瘤部位发挥抗肿瘤活性。本研究结论为临床联合应用化疗与细胞治疗获得更好疗效提供了一定的理论基础。