0 引言

宫颈癌（cervical cancer,CC）是最常见的妇科恶性肿瘤之一，全球每年大约有529 800个新诊断病例，死亡人数约为275 000例^[1]。在我国，宫颈癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势^[2]，宫颈癌防治在妇幼保健和肿瘤防治工作中占有重要地位。盆腔淋巴结转移是宫颈癌最重要的预后影响因素之一，无淋巴结转移的早期宫颈癌患者术后5年生存率为75%~90%；如发生淋巴结转移，5年生存率则降至52%~62%^[3-4]。淋巴结转移是一个多因素参与、多基因调控的复杂过程，各种生长因子、趋化因子、细胞周期蛋白、信号分子等形成的调节网络促进转移的发生。目前，从遗传学和表观遗传学角度着手，寻找用于肿瘤早期诊断，或者预测肿瘤转移和预后的分子标志物，以及能够作为生物治疗的靶标，已成为肿瘤防治研究的热点^[5-6]。

微小RNA（microRNAs,miRNAs）是广泛存在于真核生物中的一类内源性非编码单链小RNA，由19~25个核苷酸组成，由编码或非编码基因转录而来。miRNAs的转录具有组织和时间特异性，通过与目标messenger RNA（mRNA）的碱基互补配对，进而抑制蛋白翻译和（或）降解靶mRNA，在转录后水平调控基因的表达^[7]。诸多研究发现，miRNAs在正常组织和肿瘤组织中的表达水平并不相同，与多种肿瘤的发生、侵袭、转移等密切相关^[8-10]，但miRNAs在宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移中扮演的角色尚不清楚。本研究以是否有盆腔淋巴结转移作为分组标准，筛选在宫颈鳞癌转移过程中表达水平有显著差异的miRNAs，为深入研究miRNAs在宫颈鳞癌转移及预后中发挥的作用提供实验依据和理论基础。

1 资料与方法 1.1 研究样本

组织标本及相关临床资料由广州市妇女儿童医疗中心肿瘤妇科提供。选择2011年12月——2014年6月间由该科室收治的行宫颈癌根治性子宫全切术+盆腔淋巴结清扫术的24例宫颈鳞癌患者，平均年龄48.2岁（30~68岁）。收集癌组织样本，同时采集患者的临床资料。所有患者符合以下特征：（1）具有白带异常、阴道出血、宫颈糜烂、宫颈肥大、接触性出血等一项或几项临床症状、体征，符合相关手术指征；（2）均经两位以上有经验病理医师独立检查确诊为宫颈鳞状细胞癌；（3）术前均未接受过放疗。该研究已获得深圳市人口和计划生育科学研究所、广州市妇女儿童医疗中心伦理委员会同意，患者及家属均已知晓研究计划并签署知情同意书。24例患者术前HPV-DNA检测均为（+）。标本离体30 min内置于液氮保存。

1.2 实验分组及miRNA芯片操作

根据患者术后病理检查结果，将病例分为盆腔淋巴结转移组（n=8）和未转移组（n=16）。使用AllPrep DNA/RNA/miRNAs提取试剂盒（德国Qiagen公司）提取组织总RNA后，采用美国Affymetrix公司的FlashTag Biotin HSR试剂盒对总RNA中的小分子RNA进行加尾和生物素标记，然后将样本用GeneChip Hybridization和Wash and Stain试剂盒与Affymetrix miRNA 4.0芯片进行杂交和洗染，最后将芯片置于GCS3000型芯片扫描仪（美国Affymetrix公司）扫描，具体操作步骤按照说明书进行。

1.3 实时定量RT-PCR法验证miRNA表达差异

取等量材料和方法1.2中提取的每个临床组织标本总RNA，用miScriptⅡRT试剂盒（德国Qiagen公司）反转录合成cDNA，然后以cDNA为模版，用miScript SYBR^® Green PCR试剂盒（德国Qiagen公司），在7500型实时荧光定量PCR仪（新加坡Applied Biosystems公司）上进行实时定量PCR检测。反应体系20 μl，反应条件：95℃ 15 min，激活DNA聚合酶；40个循环的PCR反应，包括：变性94℃ 15 s，退火55℃ 30 s，延伸70℃ 30s，U6 snRNA作为荧光定量的内参基因。实时定量RT-PCR的相对表达量采用2^-ΔΔCt法计算，Ct值即实时荧光定量PCR仪监测到的循环阈值，ΔCt=（Ct_miRNA-Ct_U6），ΔΔCt=ΔCt_转移组-ΔCt_未转移组，转移组相对于未转移组miRNA表达量倍数=2^-ΔΔCt。

1.4 数据分析

患者的临床和病理资料采用SPSS18.0软件进行卡方分析，P<0.05为差异有统计学意义；芯片数据采用Affymetrix公司配套软件进行分析：将扫描芯片获得的数据导入Expression Console软件进行芯片质量检测和归一化处理，处理后的数据按照上述实验分组导入Transcriptome Analysis Console软件对miRNAs组间表达差异进行方差分析比较，当同时满足ANOVA P-value<0.05且Fold Change（linear）<-2或>2时，认为存在差异表达。实时定量RT-PCR结果组间比较采用t检验，P<0.05认为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 患者临床和病理资料分析

在24例宫颈鳞癌样本中，盆腔淋巴结转移组8例，未转移组16例，两组在年龄（P=0.007）、FIGO分期（P=0.020）以及侵及宫体（P=0.002）方面差异有统计学意义，而在分化程度、肿瘤最大直径、术前化疗等方面差异无统计学意义，见表 1。

2.2 miRNA芯片筛查与盆腔淋巴结转移相关miRNAs表达

盆腔淋巴结转移组相对于未转移组，有5个miRNAs存在差异表达且全部表现为上调，分别为miR-5585-3p、miR-6735-5p、miR-8073、miR-658和miR-492，具体结果和信号表达热图分别见表 2和图 1。

2.3 miR-492和miR-658在盆腔淋巴结转移组和未转移组间的表达

在存在差异表达的5个miRNAs中，miR-658和miR-492表达上调的倍数较大，分别为4.24和5.43，方差分析的P值分别为0.0472和0.0117，提示这两个miRNAs可能与宫颈癌转移密切相关，具体结果见表 2和图 2。

2.4 实时定量RT-PCR验证miR-492和miR-658的表达

根据芯片筛查的结果，选择表达量变化最显著的两种miRNA：miR-492和miR-658，利用实时定量RT-PCR检测它们在两组宫颈癌标本中的表达差异。结果显示：这两种miRNA在淋巴结转移组中的表达量较未转移组均有显著增加，与芯片结果一致，见图 3。

3 讨论

众所周知，转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，也是导致患者死亡的主要原因之一。在癌症的发生和转移过程中，除了编码基因的突变或表达异常导致的正常细胞增殖、分化和凋亡等生理功能改变之外，还可观察到非编码转录本如miRNAs的表达异常，该异常表达最终表现为促癌还是抑癌作用，取决于其发生调控紊乱的靶点是促癌还是抑癌基因^[11-13]。Calin等发现，超过50%的miRNAs编码序列定位在与癌症相关的基因组区域或脆性位点^[14]。肿瘤转移涉及多种黏附分子、蛋白水解酶的作用，整个过程受到细胞调节因子、信号转导因子等调控，而这些因子大部分在癌组织中的表达是受到miRNAs调控的。到目前为止，有近70个miRNAs被认为与宫颈癌的发生密切相关，如miR-15a、miR-21、miR-34a、miR-145、miR-218、miR-375和miR-497等^{[7, 15-16]}；而宫颈癌转移相关miRNAs的研究报道并不多见。

本研究发现，宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移组相对于未转移组，有5个miRNAs存在显著差异表达，且全部表现为上调，其中以miRNA-658和miRNA-492上调的倍数较大。经文献检索发现，miRNA-492由角蛋白19（Keratin 19）基因转录本剪切而来，在转移性肝母细胞瘤、直肠癌、胰腺癌组织中均发现表达上调，与这些肿瘤的发生和转移有关^[17-19]。但是miRNA-492在不同组织来源的肿瘤中的致癌机制可能不同，例如Jiang等^[20]发现miRNA-492在部分肝癌组织中高表达，且出现这种高表达的患者生存时间较表达水平无明显升高的患者短，进而在体外实验发现miRNA-492通过抑制抑癌基因PTEN来实现致癌作用；而Shen等^[21]研究发现在乳腺癌细胞中miRNA-492通过抑制SOX7基因促进癌细胞增殖。关于miRNA-658的文献报道较少，Cummins等^[22]在结肠癌细胞系中首次发现miRNA-658，并且将其编码序列定位在22号染色体；Guo等^[23]证实miRNA-658在胃癌组织中表达上调。本研究观察到这两种miRNA在宫颈鳞癌盆腔淋巴结转移患者中表达上调，与上述文献报道一致。由此可以证明，miRNA-658和miRNA-492的表达上调与宫颈鳞癌向盆腔淋巴结转移有一定的相关性，但是其在淋巴结转移过程中的具体作用机制，比如其调控了哪些肿瘤转移相关基因、对下游哪些信号通路产生了影响、以及最终导致哪些蛋白因子功能的抑制或者激活等，还有待于进一步的深入研究；这两种miRNA的表达水平与患者术后生存状况的统计学关系，也待随访到一定时间后进行比较分析，今后的研究工作将随着术后随访时间的延长和样本数量的增加，得到更详细的结果。