2016, Vol. 43文章信息
- NRP-1过表达对乳腺癌细胞MDA-MB-231、SK-BR-3生物学行为的影响
- Effects of NRP-1 Overexpression on Biological Behaviors of Breast Cancer Cell Lines MDA-MB-231 and SK-BR-3
- 肿瘤防治研究, 2016, 43(8): 678-684
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2016, 43(8): 678-684
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2016.08.006
- 收稿日期: 2015-10-09
- 修回日期: 2015-12-10
引用本文 |
2. 271000 泰安，泰山医学院附属医院肿瘤科;
3. 221000 徐州，徐州医科大学附属医院肿瘤科
2. Department of Oncology, Affiliated Hospital of Taishan Medical University, Taian 271000, China;
3. Department of Oncology, The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical University, Xuzhou 221000, China
肿瘤血管生成在乳腺癌发展、浸润、转移中起着关键作用[1]。神经纤毛蛋白-1（neuropilin-1,NRP-1）是一个由923个氨基酸组成的非酪氨酸蛋白激酶[2]。NRP-1可作为VEGF（vascular endothelial growth factor）的受体，以独立或依赖VEGFR-2（vascular endothelial growth factor receptor 2）的方式参与新生血管的生成及肿瘤的发展及转移[3]。我们通过构建NRP-1过表达乳腺癌细胞模型，观察其对乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭能力的影响。
1 材料与方法 1.1 材料乳腺癌MCF-7细胞株购自南京凯基生物公司，MDA-MB-231、SK-BR-3细胞株购自中国科学院上海细胞库，BT549、T47D、Bcap37细胞株、质粒pcDNA3.1由江苏省肿瘤生物治疗研究所保存，质粒pCR-blunt购自美国Invitrogen公司，Phusion聚合酶、限制性内切酶EcolⅠ、限制性内切酶HindⅢ购自美国NEB公司，DMEM、RPMI 1640干粉培养液、胎牛血清为美国Gibco公司产品，抗兔NRP-1多克隆抗体购自美国Cell Signalling Technology公司，抗β-actin鼠单克隆抗体、辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG、辣根过氧化酶标记马抗小鼠IgG购自北京中杉金桥公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自南京碧云天生物试剂研究所，G418购自美国Sigma公司，CCK-8试剂盒购自日本同仁化学研究所，AnnexinV-APC/7-AAD试剂盒购自美国BD Biosciences公司，Transwell小室购自美国Corning公司，Matrigel胶购自美国BD Biosciences公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人乳腺癌细胞MCF-7、SK-BR-3及T47D培养在含有10%胎牛血清的DMEM培养液中，BT549、MDA-MB-231及Bcap37培养在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内常规传代培养。
1.2.2 Western blot鉴定NRP-1在乳腺癌细胞株中的表达提取MCF-7、SK-BR-3、BT549、T47D、MDA-MB-231、Bcap37六种乳腺癌细胞的总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取相等总蛋白量进行SDS-PAGE电泳，分离后，转至NC膜。明胶室温封闭1 h，一抗4℃冰箱平放过夜，Washing buffer洗涤3次，二抗室温孵育1 h，Washing buffer洗涤3次，ddH2O清洗3 min，倒掉ddH2O，置入新鲜配制的显色液中显色。
1.2.3 pCR-blunt-NRP-1克隆载体的构建取NRP-1表达量较高的MCF-7乳腺癌细胞，TRIzol法提取总RNA，反转录得到含NRP-1基因信息的cDNA，以cDNA为模板用Phusion酶行PCR扩增目的片段，扩增条件为：98℃ 2 min预变性，98℃ 30 s,68℃ 30 s，72℃ 2 min，共35个循环，最后72℃延伸2 min。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收即得到目的基因片段。将目的基因片段与pCR-blunt载体用T4DNA连接酶连接，连接产物转化感受态细胞，挑取单克隆菌落摇菌过夜，小量提取质粒经EcolⅠ单酶切鉴定正确后送上海英俊公司测序，测序正确后将质粒命名为pCR-blunt-NRP-1。
1.2.4 pcDNA3.1-NRP-1表达载体的构建与鉴定EcolⅠ单酶切重组质粒pCR-blunt-NRP-1和pcDNA3.1，反应产物用0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测并观察目的条带。胶回收NRP-1基因片段和pcDNA3.1，T4DNA连接酶连接。连接产物转化感受态细胞DH-5α。第二天挑取数个单克隆菌落，摇菌过夜后小提质粒，Hind Ⅲ单酶切鉴定重组质粒，将鉴定正确的质粒命名为pcDNA3.1-NRP-1，菌液-80℃保存。
1.2.5 NRP-1过表达稳定表达系的筛选先筛选抗生素G418剂量，将MDA-MB-231、SK-BR-3细胞以8 000个/孔接种于24孔板，设定G418浓度梯度为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1 000 μg/ml，每个浓度设3复孔。计算活细胞数并取3孔的平均值。以10~14天杀死全部细胞的最低浓度为筛选浓度。测得MDA-MB-231、SK-BR-3的筛选浓度分别为600、500 μg/ml。转染前24 h将MDA-MB-231、SK-BR-3细胞以4×l05个/孔的密度接种于6孔板，温箱中培养24 h后，按照Invitrogen公司LipofectamineTM 2 000的说明书介导NRP-1表达质粒与空质粒转染两种乳腺癌细胞，分别用600、500 μg/ml G418筛选出稳定转染的MDA-MB-231、SK-BR-3细胞株，并予以扩大培养。后续实验将每种细胞分为未进行转染的正常细胞即空白对照（blank control，BC），转染空质粒的阴性对照（negative control，NC）及转染NRP-1表达质粒的过表达（pcDNA3.1-NRP-1）3组，共计6组。
1.2.6 实时荧光定量RT-PCR分析NRP-1 mRNA表达情况TRIzol法提取总RNA，M-MLV反转录酶反转录合成cDNA。采用LightCycler 480 SYBR Green ⅠMaster荧光定量PCR试剂盒检测6组细胞NRP-1的mRNA表达情况。NRP-1及内参β-actin引物序列如下：NRP-1上游引物：5’-GGAAGCTCTGGGCATGGAAT-3’，下游引物：5’-AGGAATCCTCTCCGGGAGTC-3’；β-actin上游引物：5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，下游引物：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’。反应条件：95℃变性5 s，60℃退火，延伸40 s，循环40次。荧光定量PCR反应结束后，由电脑自动分析结果，计算Ct值。NRP-1相对表达量用2-ΔΔCt表示，其中ΔΔCt =[Ct目的基因的平均值(样本组)- Ct管家基因的平均值(样本组)]-[Ct目的基因的平均值(校正组)- Ct管家基因的平均值(校正组)]。
1.2.7 Western blot分析NRP-1蛋白质的表达情况收集6组细胞，具体处理方法如1.2.2。
1.2.8 CCK-8法检测NRP-1过表达对乳腺癌细胞增殖的影响取6组细胞以5 000个/孔密度接种于96孔板，每组设3个副孔，同时设空白对照孔（只加培养液），分别培养24、48、72和96 h后吸去培养液，每孔加入不含血清的培养液，再加入CCK-8试剂10 μl，继续培养2 h后，于酶标仪波长450 nm处测OD值。抑制率（%）=（1-OD实验组/OD对照组）×100% 。
1.2.9 AnnexinⅤ-APC/7-AAD法结合流式细胞仪检测细胞凋亡率分别取对数生长期的6组细胞，以4×105个/孔密度接种于6孔板中培养，使每孔总体积为2 ml，每孔设3个复孔，常规培养24 h。24 h后1 000 r/min离心5 min，收集细胞；用预冷的PBS洗涤细胞2次（1 000 r/min离心5 min），1×Binding buffer洗一次，收集细胞；加入100 μl 1×Binding buffer重悬细胞； 加入5 μl AnnexinV-APC，室温避光孵育15 min后；加入1 ml 1×Binding buffer离心，弃上清液后，于200 μl 1×Binding buffer重悬细胞，再加入5 μl 7-AAD混匀；1 h内用流式细胞仪检测。
1.2.10 Transwell细胞迁移实验及侵袭实验 1.2.10.1 Transwell细胞迁移实验取MDA-MB-231空白对照（blank control,BC），阴性对照（negative control,NC）及过表达（pcDNA3.1-NRP-1）3组细胞。常规洗涤、消化，离心，收集细胞制成单悬，用无血清的培养液调整细胞密度为1×106/ml，接种于Transwell小室的上室150 µl，下室为10% FBS的培养液600 µl，培养12 h后，用棉签擦去上室内的细胞，95%甲醇固定20 min，PBS洗三遍，结晶紫染色30 min，拍照，计数。
1.2.10.2 Transwell细胞侵袭实验Transwell小室预处理：外膜涂50 μl纤维粘连蛋白（fibronection,FN），用枪头摊平，风干后内膜平铺以1:3比例稀释的Matrigel稀释液30 μl，37℃过夜凝胶。收集细胞制成单细胞悬液，调整细胞密度为1.5×106/ml接种于Transwell小室的上室，其他步骤同迁移实验。
1.3 统计学方法采用SPSS16.0统计软件进行统计处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析检验，假设检验水准按α=0.05判定，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 NRP-1在不同乳腺癌细胞株中的表达NRP-1在六种乳腺癌细胞中都有表达。MCF-7表达量较其他细胞高，MDA-MB-231、SK-BR-3、T47D表达量较低。后续实验我们从MCF-7细胞提取NRP-1的RNA，以MDA-MB-231、SK-BR-3两种乳腺癌细胞用于过表达相关研究，见图 1。
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| 1: MCF-7; 2: SK-BR-3; 3: BT549; 4: T47D; 5: MDA-MB-231; 6: Bcap37 图 1 Western blot鉴定乳腺癌细胞株中NRP-1蛋白表达 Figure 1 Expression of NRP-1 protein in breast cancer cell lines detected by Western blot |
PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，见一约1.8 kb的条带，与目的基因的大小相符，见图 2A。使用限制性内切酶EcolⅠ单酶切初步鉴定构建的重组质粒pCR-blunt-NRP-1，1.0%琼脂糖凝胶电泳可见大小约1.8 kb及3.5 kb两条清晰条带，与理论值相符，见图 2B。测序结果显示PCR产物与GeneBank公布的人NRP-1基因序列一致。
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| A: amplified NRP-1; M: 1 kb DNA marker; B: recombinant plasmid; M: 1 kb DNA marker 图 2 NRP-1基因片段的扩增及pCR-blunt-NRP-1重组质粒的酶切 Figure 2 Fragment NRP-1 amplified by PCR and recombinant plasmid digested with restriction enzyme |
用T4DNA连接酶连接pcDNA3.1-NRP-1，Hind Ⅲ酶切鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳可见大小约6 700 bp及600 bp的两条条带，与理论值相符，见图 3。
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| M: 1 kb DNA marker 图 3 pcDNA3.1-NRP-1重组质粒的酶切 Figure 3 Recombinant plasmid pcDNA3.1-NRP-1 digested by Hind Ⅲ |
在MDA-MB-231细胞、SK-BR-3细胞，NRP-1在过表达组中的表达量较相应对照组细胞上调约4倍，和对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），见表 1。
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脂质体转染MDA-MB-231、SK-BR-3细胞后，与对照组比较，MDA-MB-231和SK-BR-3细胞过表达组（pcDNA3.1-NRP-1）中NRP-1蛋白的表达量分别升高了约13倍和2倍，与对照组比较差异有统计学意义（MDA-MB-231： pcDNA3.1-NRP-1组与BC、NC组比，P=0.002、P=0.005；SK-BR-3：pcDNA3.1-NRP-1组与BC、NC组比，P=0.003、P=0.029），见图 4。
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| A: MDA-MB-231; B: SK-BR-3 图 4 过表达组pcDNA3.1-NRP-1中NRP-1蛋白的表达量 Figure 4 Expression of NRP-1 protein in pcDNA3.1-NRP-1 group |
依据MDA-MB-231、SK-BR-3细胞空白组、阴性对照组、pcDNA3.1-NRP-1组在24、48、72和96 h的细胞增殖情况。两种细胞的pcDNA3.1-NRP-1组与对照组相比差异有统计学意义（P<0.05)；而阴性对照（NC）与空白对照（BC）组相比差异无统计学意义（P<0.05），见表 2。
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pcDNA3.1-NRP-1组细胞凋亡率低于对照组，两组比较差异有统计学意义（P<0.05），而阴性对照与空白对照组相比差异无统计学意义（P<0.05），见表 3、图 5。
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| A: MDA-MB-231 blank control; B: MDA-MB-231 negative control; C: MDA-MB-231 pcDNA3.1-NRP-1; D: SK-BR-3 blank control; E: SK-BR-3 negative control; F: SK-BR-3 pcDNA3.1-NRP-1 图 5 NRP-1过表达后对细胞凋亡的影响 Figure 5 Cell apoptosis rates after lipofectamine transfection |
结果显示：空白对照组、阴性对照组和过表达组穿过Transwell小室的细胞数分别为（94.0±4.1）、（90.0±3.0）、（144.0±5.13）个，过表达组穿膜细胞数较空载体组及正常组明显升高，差异有统计学意义（pcDNA3.1-NRP-1组与BC、NC组比，P=0.000、P=0.000），见图 6。
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| A: blank control (BC); B: negative control (NC); C: pcDNA3.1-NRP-1 图 6 NRP-1过表达对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响 (×400) Figure 6 Migration abilities of MDA-MB-231 cells detected by Transwell (×400) |
结果显示：空白对照组、阴性对照组和过表达组穿过Transwell小室的细胞数分别为（56.0±5.12）、（55.0±4.5）、（86.0±5.14）个，过表达组穿过的细胞数明显高于对照组和空载体组，差异有统计学意义（pcDNA3.1-NRP-1组与BC、NC组比，P=0.002、P=0.001），见图 7。
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| A: blank control (BC); B: negative control (NC); C: pcDNA3.1-NRP-1 图 7 NRP-1过表达对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响(×400) Figure 7 Invasion abilities of MDA-MB-231 cells detected by Transwell (×400) |
据2014年美国癌症学会统计，乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤[4]，近年来我国乳腺癌发病率不断上升，是导致女性死亡的主要病因之一。乳腺癌的治疗包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗及分子靶向治疗，但总体治疗效果不尽如人意[5]。肿瘤生长依赖于血管生成，VEGF为肿瘤抗血管生成的主要靶点，其组织内新生血管形成是导致转移和进展的主要原因[6]。贝伐珠单抗是针对VEGF的人源化单克隆抗体，是靶向VEGF的典型代表药物，但有研究表明贝伐珠单抗并没有使OS显著提升[7]，且长期使用会出现高血压、出血、器官损伤、心脏衰竭等一系列严重的不良反应[8]。因此急需寻找新的靶向治疗乳腺癌的方法。
NRP-1由胞外区、跨膜区、胞内区三部分组成，不仅表达于内皮细胞中，在乳腺癌、胰腺癌、肺癌、喉癌等多种肿瘤组织中广泛表达，表达量高于相应正常组织[9-12]。NRP-1作为VEGF的协同受体，其表达可增强VEGF与VEGFR-2的结合，从而增加其促进细胞有丝分裂及血管生成的活性[13]。NRP-1的过表达导致大量的血管生成，而NRP-1突变的胚胎中显示了血管缺陷，特别是神经脉管系统[14]。在多种肿瘤模型中如非小细胞肺癌、鼻咽癌、骨肉瘤等，用小干扰靶向NRP-1也明显抑制了肿瘤生长、血管生成、转移，这显示了NRP-1在血管生成中的重要作用[15-17]。王雅冰等[18]研究发现，乳腺癌组织中NRP-1阳性表达率明显高于乳腺纤维腺瘤和乳腺囊性增生症，其表达量高低与腋窝淋巴结转移和TNM分期密切相关，可作为评价肿瘤预后及恶性程度的指标，因此NRP-1或可成为乳腺癌靶向治疗的新型受体。目前关于NRP-1对乳腺癌细胞生物学行为影响的研究较少，本研究通过上调乳腺癌细胞株NRP-1的表达，探索其对乳腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响。
脂质体转染是非病毒转染法中运用最为广泛的一种方法，其较病毒转染法具有低毒、低免疫原性的特点，且其操作简便、转染效率较高，既可以用于稳定转染，也可以用于瞬时转染[19]。本研究通过脂质体稳定转染的方法使原本低表达NRP-1的乳腺癌细胞株MDA-MB-231、SK-BR-3过表达该基因，用Western blot、RT-qPCR方法检测到细胞NRP-1蛋白、RNA表达量增加。在CCK-8增殖实验中发现，NRP-1过表达组较对照组细胞增殖率增加。流式细胞仪检测结果表明NRP-1过表达组较对照组细胞凋亡率有所减少。Transwell细胞侵袭及迁移实验结果发现，NRP-1过表达组穿过小室的细胞数目较对照组的细胞数明显增多。表明NRP-1能够促进乳腺癌细胞的增殖、抑制其凋亡，并且能够显著增加细胞的侵袭及迁移能力，在乳腺癌发生、浸润、转移过程中起着一定作用。预示NRP-1可以作为治疗乳腺癌的新靶点，为乳腺癌的治疗提供了一个新思路。
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