0 引言

肺癌患者中，以非小细胞肺癌类型居多，但大多数非小细胞肺癌患者在确诊时已属晚期，很难通过手术或放化疗手段进行根治。此外，有超过50%的早期患者，尽管经过手术、放化疗以及一些积极的辅助治疗，最终仍会出现局部复发或远处转移^[1]。因此，积极寻找肺癌特异的相关基因，弄清其在肺癌发生发展中的作用和机制，对肺癌的早期诊断和治疗具有重要意义。本课题组前期研究表明Rap2a基因在肺癌中的蛋白表达水平高于正常组织^[2]，提示Rap2a基因可能与肺癌的发生发展相关。在此基础上，本研究将进一步探讨Rap2a对人肺癌细胞株A549和H1299的迁移侵袭和增殖凋亡能力的影响，了解其相关信号通路，为探讨Rap2a基因与人肺癌发生发展的关系提供一定实验依据。

1 材料与方法 1.1 细胞株和试剂

人肺癌细胞株H1299和A549为本实验室保存，购自中国科学院上海细胞库。新生牛血清购自杭州四季青公司。质粒转染试剂Lipofectamine^TM 2000为美国Invitrogen公司产品。Transwell小室购自美国Corning公司。兔抗人Rap2a抗体购自Abcam公司，β-actin一抗购自美国Santa Cruz公司。荧光二抗羊抗鼠和荧光羊抗兔IgG购自美国LI-COR公司，二抗孵育后条带经Odyssey扫描仪扫描处理。

1.2 细胞转染

待肺癌细胞处于约80%~90%融合时进行转染。按小皿的标准计算，每孔加入2 μg pcDNA3.1-Rap2a质粒，用Lipofectamine^TM 2000转染试剂进行转染，转染24 h后提取蛋白观察转染效率。

1.3 划痕实验

转染Rap2a后的A549和H1299细胞接种到6孔板中，控制密度在80%左右，含10%FBS的DMEM完全培养液培养12 h，待细胞完全贴壁后换用无血清的培养液培养过夜，使细胞休克，停止增殖。用2.5 μl枪头在6孔板内划两条相互垂直的线，PBS洗去脱落细胞，并在划痕旁做标记，用无血清的培养液培养。选取0、6、12、18和24 h做为时间点，每隔6 h在倒置显微镜下拍照一次。

1.4 Transwell小室侵袭实验

H1299和A549细胞转染Rap2a 24 h后，用胰酶消化收集细胞，无血清培养液制成浓度为4×10⁴/ml的细胞悬液150 μl，加入铺有Matrigel胶的Transwell小室，置培养箱中过夜，下室加入600 μl含有10% FBS的DMEM培养液，继续在培养箱中培养12 h。12 h后，甲醇固定，结晶紫染色10 min，用湿棉签擦去上室底部膜表面上的细胞后显微镜下随机取5个视野拍照，计数并统计结果。

1.5 细胞增殖活性的检测

取转染Rap2a后的肺癌细胞，制成单细胞悬液，接种至96孔板，每孔5×10³/ml，每组细胞设5个复孔。37℃和5%CO₂实验条件下常规培养。于d1、2、3、4各取出一块96孔板进行检测。每孔加入CCK-8 10 μl，37℃培养2 h后，酶标仪上检测450 nm处的吸光度值。实验重复3次。

1.6 Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测细胞凋亡

细胞转染同前，然后以PBS冲洗两次，按照说明书先以Annexin V-FITC孵育后再加以PI，用流式细胞术检测肺癌细胞凋亡情况，用FlowJo软件对检测结果进行分析。

1.7 Western blot检测Rap2a、ERK、p-ERK、Akt和p-Akt473蛋白的表达

PBS冲洗细胞三次，细胞裂解buffer提取各组细胞中的总蛋白。蛋白样品用12.5% SDS-PAGE跑胶后转膜至硝酸纤维素膜上。脱脂牛奶室温封闭2 h后用相应抗体4℃过夜。充分洗膜后室温孵育二抗1 h，再次洗膜后经Odyssey扫描仪显影。

1.8 统计学方法

实验数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较采用t检验分析。使用SPSS16.0统计软件进行统计分析，检验水准按α=0.05判定，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 Rap2a过表达促进肺癌细胞划痕愈合速度

在0 h时，对照空质粒组和Rap2a过表达组A549和H1299两种肺癌细胞迁移距离差异无统计学意义（P＞0.05），而24 h后，Rap2a过表达组细胞已快将划痕区填充，而对照组细胞仍存在较大的划痕区，差异有统计学意义（P＜0.05）。说明随着时间的延长，Rap2a能够促进肺癌细胞的迁移能力，并且在24 h其促进肿瘤迁移的作用更加明显，见图 1。

2.2 Rap2a过表达可促进肺癌细胞的侵袭能力

Transwell小室内面铺一层Matrigel胶在培养箱内过夜之后，检测转染细胞的侵袭能力。对于两种肺癌细胞，Rap2a过表达组细胞的侵袭能力明显高于对照组，穿过Transwell小室的细胞明显增多，差异有统计学意义（P＜0.05）。提示Rap2a表达水平增加后，肿瘤细胞的侵袭能力也得到不同程度的增加，此结果与划痕实验结果一致，见图 2。

2.3 Rap2a过表达对细胞增殖和凋亡能力的影响

两种肺癌细胞经Rap2a质粒转染处理后24、48、72和96 h分别用酶标仪检测吸光度值，结果显示实验组与对照组细胞增殖能力无明显变化，其吸光度值在24、48、72和96 h差异均无统计学意义（P＞0.05），见图 3A。同样的，于转染后24 h检测细胞凋亡情况，以荧光素FITC标记的Annexin V荧光信号和碘化丙啶（PI）荧光信号分别显示早期凋亡和晚期凋亡，运用流式细胞术进行检验，结果显示实验组和对照组相比，细胞早期凋亡和晚期凋亡数目无明显变化。提示高表达Rap2a对肺癌细胞的早期和晚期凋亡无明显影响，见图 3B。

2.4 Western blot 检测Bcl-2、Bax、ERK、Akt、Rap2a蛋白的表达

Western blot检测细胞增殖凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax蛋白水平变化，结果显示其蛋白水平无明显变化，进一步验证了CCK-8及Annexin V/FITC流式细胞术的检测结果。Western blot检测参与调控细胞迁移侵袭的信号通路分子ERK和Akt，结果发现p-Akt473的活性随Rap2a的增高而活性增加，见图 4。

3 讨论

肿瘤的发生是一个多步骤的过程，其特点是失控性增殖和侵袭^[3]。参与肿瘤发生的多种基因在肿瘤和正常组织中的表达存在显著差异，发现和研究这些表达异常的基因对于揭示肿瘤发生发展的分子机制，并提供肿瘤早期防治的标志物具有重要意义。

Rap蛋白是一个小分子量的GTP结合蛋白，属Ras超家族。小G蛋白Ras超家族在细胞的许多生理过程中都发挥了极其重要的作用，包括细胞生长、分化、小泡中介的胞内运输以及细胞骨架的组成等^[4]。近年来，有研究者发现Rap2与肿瘤的形成及恶性转变有关，其下游效应因子RPIP9在乳腺癌中的表达增高，而且其活性与乳腺癌的恶性程度密切相关^[5]。它的另一下游效应因子MAP4K4在多种肿瘤组织中均高表达，其活性程度与肿瘤的侵袭及转移相关^[6]。Lin等在卵巢癌上的研究结果也验证了Rap蛋白的这一特性^[7]。我们课题组前期也发现Rap2a在多种肿瘤细胞中高表达，且转染Rap2a可促进骨肉瘤细胞的迁移侵袭，运用siRNA沉默Rap2a使其下调可以抑制肿瘤细胞的侵袭能力^[8]。在本实验中，我们发现Rap2a过表达也可以促进肺癌细胞的迁移和侵袭能力，并且对肿瘤细胞的增殖和凋亡无明显影响。细胞凋亡过程受多种凋亡调控蛋白影响，在已知的凋亡调控蛋白中，Bcl-2家族在各类刺激信号引发的凋亡过程中起关键作用。而Bax则是能与Bcl-2作用相对抗的促凋亡基因，两者在细胞内动态共存。通过CCK-8、Annexin V/FITC流式细胞术和对增殖凋亡相关蛋白检测，结果提示Rap2a过表达后对肿瘤细胞的增殖凋亡无明显影响。

磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）家族参与乳腺癌、肺癌、黑色素瘤和淋巴瘤等多种人类肿瘤的发生^[9]。而且，PI3K-Akt信号通路也调控肿瘤的迁移侵袭。在乳腺癌和卵巢癌中，Akt2能通过Ⅳ型胶原蛋白上调整联蛋白的表达，使细胞的侵袭性增强^[10]。在鳞状细胞癌中，Akt的持续高表达能诱导上皮间质化（epithelial mesenchymal transition，EMT），促进组织侵袭和转移所需的动力^[11]。PI3K还可以通过与E-cadherin、β-catenin和血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）形成复合物经由PI3K-Akt信号通路的活化参与血管内皮信号传递促进肿瘤血管的生成，而且VEGF-2也以PI3K-Akt信号通路方式介导内皮细胞的黏附和迁移^[12]。已有报道显示Ras可诱导PI3K/Akt信号通路活化参与胶质瘤的发生^[13]。最新研究发现，Rap2家族的Rap2b可通过ERK信号通路促进人乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭^[14]。那么，Rap2a是否介导PI3K/Akt或ERK信号通路促进肺癌细胞的迁移侵袭呢？本实验结果显示，过表达Rap2a后，A549和H1299两种肺癌细胞的p-Akt473的活性明显升高，而p-ERK无明显变化，提示Rap2a的促肿瘤细胞运动特性可能与PI3K/Akt信号通路的激活密切相关，而与ERK信号通路无关。

综上，本研究发现Rap2a外源性高表达可使PI3K/Akt信号通路活化，也印证了Rap2a在PI3K/Akt信号转导途径中有一定的作用，这为我们展示了研究Rap2a的巨大潜力。在今后的研究中，我们将进一步探索PI3K/Akt信号通路中具体参与的分子调控机制，并致力于Rap2a在肺癌细胞中的功能研究，运用裸鼠成瘤实验以验证体外实验的结论。