0 引言

在西方发达国家，子宫内膜癌是女性生殖系统发病率最高的恶性肿瘤^[1]，近年来，在我国发病率也明显增高，其中以子宫内膜样癌（endometrioid carcinoma, EC）最为常见^[2]。

细胞周期的正常进行依赖于细胞周期蛋白（Cyclin），细胞周期蛋白依赖性激酶（Cyclin-dependent kinase, CDK）和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（Cyclin-dependent kinase inhibitor，CKI）三者共同的作用。p57^kip2属于CKI家族中发现最晚的因子，负向调控细胞周期的进行，在许多肿瘤中表达降低; Cyclin E则推动细胞周期向前进行，在许多肿瘤中过表达^[3]。Cyclin E和p57^kip2的联合作用，使细胞周期处于动态平衡中。本课题组前期研究发现，p57^kip2在子宫内膜癌组织中的表达与在其他肿瘤组织中的表达有差异，推测可能与雌、孕激素的作用有关^[4]。现阶段，孕激素已经用于子宫内膜癌的保守治疗，但具体的作用机制仍不明^[5]。本实验拟选取中分化EC JEC细胞进行体外培养，并采用倒置光学显微镜、透射电子显微镜、MTT、Western blot等实验技术和方法，观察JEC细胞的形态变化，检测不同浓度孕酮（progesterone, P）对JEC细胞生长的影响，联合检测不同浓度P对p57^kip2和Cyclin E蛋白表达的影响，从而进一步探讨孕激素对EC细胞周期的影响及孕激素在EC发生发展中的作用。

1 材料与方法 1.1 材料

人EC JEC细胞株（遵义医学院吴中明教授馈赠），RPMI1640培养液、胎牛血清（美国Hyclone公司），孕酮（北京华迈科公司），鼠抗人p57^kip2单克隆抗体、鼠抗人Cyclin E单克隆抗体（美国Santa Cruz公司），内参鼠抗人β-actin单克隆抗体、二抗抗鼠抗体（上海基因科技有限公司），Western blot相关试剂（上海碧云天生物技术研究所）。

1.2 仪器

倒置光学显微镜（德国，DM4000B）、垂直电泳-转膜装置（美国，Mini-PROTEAN）、双色红外激光成像系统（Odyssey）均由遵义医学院医学与生物学研究中心提供，透射电子显微镜（日立H-7650）由遵义医学院电镜室提供。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养

在5%CO₂、37℃饱和湿度条件下，用RPMI1640培养液（含10%胎牛血清）培养JEC细胞，待贴壁细胞达70%~80%融合，用0.25%胰酶消化细胞并传代，每3~4 d细胞传代1次。

1.3.2 治疗分组

根据预实验结果，实验选取高、中、低浓度（1×10^-4、1×10^-6、1×10^-8mol/L）的P作为药物治疗组，以不加P的JEC细胞作为治疗对照组。

1.3.3 MTT检测P作用后JEC细胞的生长率

取对数生长期的JEC细胞消化、离心，以每孔100μl接种于96孔板内（浓度为5×10⁴/ml）。实验分为3组：空白组、对照组和加药组。空白组只加完全培养液，对照组含有细胞和完全培养液，加药组含有细胞和高、中、低三种浓度P，每组5个复孔，常规培养24、48、72、96 h，各孔加20μl MTT，4 h后，各孔再加100μl二甲基亚砜（DMSO），30 min内，用酶标仪在波长490 nm处测各孔吸光度值。

1.3.4 倒置光学显微镜下观察P作用后JEC细胞的变化

取对数生长期的JEC细胞消化、离心，加入六孔板中（浓度为1×10⁶/ml），24、48、72 h后观察细胞的生长情况及形态变化。

1.3.5 透射电子显微镜下观察P作用后JEC细胞的变化

取对数生长期细胞，分别培养24、48、72 h，消化、离心，用2.5%戊二醛前固定、1%四氧化锇后固定、梯度脱水、浸透、包埋、聚合、超薄切片、电子染色，在透射电子显微镜下观察细胞的形态变化。

1.3.6 Western blot检测JEC细胞中p57^kip2、Cyclin E蛋白的表达情况

取对数生长期的JEC细胞消化、离心，接种到六孔板中（浓度为1×10⁶/ml），P作用组加入三种不同浓度的P，对照组更换等量培养液，培养24、48、72 h后，提取目的蛋白并测定蛋白的浓度。按照SDS-PAGE凝胶配制试剂盒说明书的要求，配制合适的凝胶，将蛋白与上样缓冲液混合后，沸水中煮5 min，跑胶、转膜，5%脱脂奶粉封闭。分别加入鼠抗人β-actin单克隆抗体（稀释比例为1:1 000），鼠抗人p57^kip2单克隆抗体、鼠抗人Cyclin E单克隆抗体（稀释比例均为1:200），4℃过夜，TBS洗膜，再加入荧光二抗（稀释比例为1:10 000），并避光摇床轻轻振荡2 h。最后用Odyssey双色红外激光成像系统扫描成像，测目的条带的灰度值（OD值）。

1.4 结果判定标准

1.4.1 MTT结果判定

细胞的增殖率（%）=（OD_用药组-OD_空白组）/（OD_对照组-OD_空白组）×100%^[6]。

1.4.2 Western blot结果判定

以β-actin单克隆抗体作为内参，用Odyssey双色红外激光成像系统扫描条带，出现目的条带即为阳性反应，样品目的蛋白的相对含量=OD目的蛋白/OD内参^[7]。

1.5 统计学方法

用统计软件SPSS 17.0对数据进行统计分析，统计结果以均数±标准差（x±s）的形式来表示。同一浓度不同时间或同一时间不同浓度的比较采用单因素方差分析，组间比较采用t检验，双随机变量运用相关性分析及线性回归分析，以α=0.05为检验水准，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 MTT法观察P作用后JEC细胞的生长情况

与对照组比较，中、低浓度P对JEC细胞的生长均有促进作用（P=0.011、P=0.000）; 高浓度P对JEC细胞的生长有抑制作用，差异有统计学意义（P=0.000），见图 1。

2.2 P作用后JEC细胞形态的变化

2.2.1 倒置光学显微镜下观察P作用后JEC细胞的形态变化

对照组JEC细胞贴壁生长，以椭圆形、多角形为主，胞质内可见少许分泌颗粒，细胞核多居中。中、低浓度P作用组，细胞的分布密度较对照组增高; 高浓度组细胞的分布密度较对照组降低。三种浓度的P作用JEC细胞后，细胞的形态变化均不大，见图 2。

2.2.2 透射电子显微镜下观察P作用JEC细胞后细胞的形态变化

对照组JEC细胞，细胞呈椭圆形，少量微绒毛，部分分泌泡，分泌蛋白明显，少量线粒体，核大、核仁明显; 低浓度组分泌泡最少，线粒体最少，少量微绒毛; 中浓度组，大量分泌泡，部分线粒体，微绒毛减少; 高浓度组，大量分泌泡，大量线粒体，少量破碎的微绒毛，见图 3。

2.3 Western blot检测P作用JEC细胞后p57^kip2和Cyclin E蛋白的表达情况

2.3.1 Western blot检测P作用JEC细胞后p57^kip2蛋白的表达情况

同一时间不同浓度作用比较：P作用于JEC细胞24 h，p57^kip2蛋白的表达在中浓度组最低，高浓度组最高，但均低于在对照组中的表达，中浓度组与高浓度组、对照组比较，差异有统计学意义（均P < 0.05）; 作用48、72 h时，随着P作用浓度的升高，p57^kip2蛋白的表达逐渐增高，但差异均无统计学意义（均P > 0.05）。同一浓度不同时间作用比较：随着时间的延长，三组p57^kip2蛋白的表达均呈递增趋势，中浓度组24 h与72 h比较，高浓度组24 h与48、72 h比较，48 h与72 h比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05），见图 4~7。

2.3.2 Western blot检测P作用JEC细胞后Cyclin E蛋白的表达情况

同一时间不同浓度作用比较：P作用于JEC细胞24 h，Cyclin E蛋白的表达在中浓度组最低，低浓度组最高，中浓度组与低浓度组比较，差异有统计学意义（P=0.009）; 48、72 h，随着P作用浓度的升高，Cyclin E蛋白的表达逐渐降低，仅48 h对照组与中、低浓度组比较，差异有统计学意义（均P < 0.05）。同一浓度不同时间作用比较：低浓度组Cyclin E蛋白的表达在24 h最高，48 h最低，24 h与48、72 h比较，差异有统计学意义（均P < 0.05）; 中、高浓度组，随着时间的延长，Cyclin E蛋白的表达均呈递减趋势，但仅高浓度组24 h与48、72 h比较，差异有统计学意义（均P < 0.05），见图 4~7。

2.3.3 P作用JEC细胞后p57^kip2和Cyclin E蛋白表达的相关性

按α=0.05水准，认为p57^kip2、Cyclin E蛋白表达之间有负相关关系（P=0.002, r=-0.559）。

2.3.4 P作用JEC细胞后p57^kip2和Cyclin E蛋白表达的线性回归分析

按α=0.05水准，认为P作用JEC细胞后p57^kip2和Cyclin E蛋白表达之间有线性回归关系（t=-3.374, P=0.002）。其回归方程式为：=2.005-0.371X。

3 讨论

EC是好发于绝经期妇女的恶性肿瘤，临床和流行病学调查显示，孕激素可以有效防止EC的发生、发展，长期有规律的服用孕激素可以降低EC的发生率，但具体机制并不清楚^[5]。Mentrikoski等^[8]通过对临床子宫内膜癌病例的分析，发现高浓度的P可以替代子宫全切手术治疗部分早期的子宫内膜复杂不典型性增生及高分化子宫内膜癌; Lee等^[9]通过细胞周期及Western blot等实验结果分析得出，在子宫内膜癌细胞中，P与骨化三醇的结合可以引起促凋亡蛋白的表达增高，导致细胞凋亡、细胞周期阻滞，从而延缓子宫内膜癌的发展。本实验MTT及形态观察结果显示，中、低浓度P可以促进体外培养的JEC细胞增殖，高浓度P则可抑制其增殖。

p57^kip2是CKI的CIP/KIP家族成员之一，位于人染色体11p15.5上，编码由316个氨基酸构成的蛋白质^[10-11]。Mishra等^[12]研究发现，p57^kip2蛋白在前列腺癌中低表达，且miR-21可以下调p57^kip2蛋白表达所对应的编码区，也能够减轻p57^kip2介导的功能反应。Li等^[13]通过实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测出p57^kip2蛋白在乳腺癌中低表达，并且PAK4可以通过泛素蛋白酶体途径抑制p57^kip2蛋白的表达。本课题组前期研究发现，p57^kip2在子宫内膜上皮内瘤变中表达量最高，在子宫内膜癌组织中表达略低于正常子宫内膜组织，与p57^kip2在其他肿瘤组织中的表达情况不完全相同，推测p57^kip2在子宫内膜癌组织中的表达可能与雌、孕激素有关^[4]。本实验结果显示，同一时间不同浓度作用比较，P作用于JEC细胞24 h，p57^kip2蛋白的表达在中浓度组最低，高浓度组最高，且均低于对照组的表达; 作用48、72 h，随着P作用浓度的增加，p57^kip2蛋白的表达逐渐增高。同一浓度不同时间作用比较，随着时间的延长，p57^kip2蛋白的表达呈递增趋势。提示P对p57^kip2蛋白在EC发生、发展中的调控与P作用浓度、作用时间有关。

Cyclin E位于人染色体19q12上，编码由395个氨基酸构成的蛋白质，在多数肿瘤中，Cyclin E的表达增高，说明肿瘤的发生、发展与Cyclin E的过表达有着密切的关系^[14]。Zapiecki等^[15]发现Cyclin E在子宫内膜透明细胞癌中高表达，其表达直接与S+G₂/M期细胞所占的百分率有关，且表达越高，患者的术后生存率越低。本课题组前期研究发现，Cyclin E在子宫内膜癌组织中的表达显著高于在正常子宫内膜组织和子宫内膜不典型性增生组织中的表达^[16]。本实验结果显示，同一时间不同浓度作用比较，P作用于JEC细胞24 h，Cyclin E蛋白的表达在中浓度组最低，在低浓度组最高; 48、72 h，随着P作用浓度的升高，Cyclin E蛋白的表达逐渐减少。同一浓度不同时间比较，各组均在24 h表达最高; 随着作用时间的延长，中、高浓度组则呈递减趋势。提示Cyclin E蛋白在EC发生发展中的作用也与P作用浓度、作用时间有关。

在细胞周期调控中，Cyclin可激活CDK的激酶活性，以推动细胞周期正向进行; CKI则抑制CDK的激酶活性，负向调控细胞周期进程，在正常子宫内膜细胞中，两者处于动态平衡^[17-18]。本实验结果显示，在P作用后的JEC细胞中，p57^kip2和Cyclin E蛋白之间的表达呈负线性相关关系。中、低浓度P作用JEC细胞时，p57^kip2蛋白低表达，p57^kip2负向调控细胞周期功能降低，而Cyclin E蛋白高表达，增加了CDK的激酶活性，使细胞周期由G₀/G₁期向S期转化，促进JEC细胞增殖。随着P作用浓度的增加、作用时间的延长，p57^kip2蛋白的表达逐渐增高，Cyclin E蛋白的表达逐渐降低，提示高浓度P可能诱导p57^kip2的表达增加，下调Cyclin E的表达，以抑制JEC细胞的增殖，从而达到阻滞EC发生发展的作用。