0 引言

世界卫生组织（WHO）报道，80%鼻咽癌发生在中国，是我国南方地区常见的一种恶性肿瘤^[1]，严重威胁我国人民的生命和健康。临床研究发现，鼻咽癌具有高转移、高复发和低分化的特征^[2]。转移为鼻咽癌的有效治疗带来了极大困难。实验研究表明，鼻咽癌转移与致癌因子、多个癌基因活化有关，其中EB病毒LMP1过表达与鼻咽癌转移呈正相关^[3-4]，LMP2A诱导上皮细胞-间质细胞转化被认为是EB病毒参与鼻咽癌转移证据之一^[5]，此外DNP也被认为与鼻咽癌转移相关^[6]。但是鼻咽癌高转移的确切分子机制仍不清楚。本项目组在前期的研究中，发现二亚硝基哌嗪（N,N’-Dinitrosopiperazine,DNP）促进6-10B细胞高转移，且CLU显著高表达^[7]。通过文献复习发现，在胃癌^[8]、肝癌^[9]、结肠癌^[10]等多种肿瘤中CLU表达异常，且与肿瘤转移密切相关^[11-12]。本研究首先检测CLU基因在具有不同转移侵袭能力鼻咽癌细胞系中的表达情况，再构建该基因的干扰重组质粒，验证CLU对鼻咽癌细胞系生物学功能的影响，为进一步研究鼻咽癌转移机制奠定实验基础。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 细胞系和质粒

人鼻咽癌细胞株6-10B和5-8F购自中南大学湘雅中心实验室细胞库；shRNA表达载体pSR-GFP/Neo购自美国Clontech公司。

1.1.2 试剂

T4 DNA连接酶购自（大连）中国宝生物公司；BamHⅠ与EcoRⅡ购自美国NEB公司； DNA凝胶回收试剂盒购自（广州）中国东盛生物公司；鼠抗人单克隆抗体购自英国Abcam公司；辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体购自（武汉）中国博士德公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒购自美国赛默飞公司；Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司；总RNA抽提试剂盒购自美国Sigma公司；反转录试剂盒购自日本Toyobo公司。

1.2 方法

1.2.1 pSR-GFP/Neo-NC-shRNA和pSR-GFP/Neo-CLU-shRNA重组质粒的构建

根据GenBank公布的CLU基因序列（Gen-BankAccession Number: NM_203339），遵循siRNA的设计原则，参考文献^[13]中CLU shRNA的靶点序列来设计本实验中的CLU shRNA干扰序列；以靶序列为基础设计并合成CLU shRNA的引物。将引物溶解置于沸水中，然后自然退火，反应体系：5 μl 10×NEBBuffer，1.5 μl BamHⅠ，1.5 μl EcoRⅡ，15 μl pSRGFP/Neo，加水至50 μl；将反应后产物置于37℃水浴4 h，经酶切、跑胶过程后回收大片段；将回收的产物与经BamHⅠ/EcoRⅡ线性化的pSR-GFP/Neo进行连接，反应体系：1 μl T4 DNA Ligase，1 μl 10 ×Ligase Buffer,4 μl CLU shRNA，1 μl pSR-GFP/Neo,加水至10 μl；将反应后产物置于4℃条件下过夜后即可用于制备细菌感受态并进行载体的转化；最后经挑取克隆进行鉴定确定成功后即可进行后续实验。

1.2.2 QRT-PCR

细胞用TRIzol总RNA抽提试剂盒抽提细胞总RNA，紫外分光光度计检测OD₂₆₀、OD₂₈₀值及比值，以确定RNA的浓度及纯度；另取RNA样品1 μl，1%琼脂糖凝胶电泳80 V×20 min，用凝胶成像系统观察总RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA条带，三条条带完整即可证明总RNA抽提比较完整；加入反转录酶催化合成cDNA，以SYBR qPCR Mix行荧光定量PCR验证实验组与对照组相关基因的差异性。

引物序列：CLU-F，5'-TGGCTTCCCACACTTCTGACT-3' ；CLU-R，5'-CGCCACGGTCTCCATAAATT-3'；18s rRNA-F，5'-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3 ' ；1 8 s rRNA-R，5'-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3'。按以下条件扩增：95℃ 15 s，65℃ 15 s，72℃ 32 s，40个循环，融解曲线分析：温度60℃~95℃。每个样重复3次。定量PCR所用SYBR Green PCR Master Mix购自TOYOBO公司，定量PCR仪为ABI PRISM^® 7500Sequence Detection System。

1.2.3 Transwell小室迁移实验

收集各处理组细胞，计数1×10⁵个细胞，用100 μl无血清培养液重悬，加入Transwell细胞培养板的小室上室，在下室加入600 μl完全培养液，在37℃、5% CO₂孵育24 h后，取出Transwell板，以结晶紫（0.1%）染色后置倒置显微镜下计数细胞，计数3个高倍视野（×100）下从上室迁移穿过滤膜到达下室的细胞数。

1.2.4 Transwell小室侵袭实验

溶解Matrigel过夜，用预冷的无血清培养液以1:3的体积比稀释Matrigel，取40 μl加入预冷的Transwell小室中，37℃孵育2 h使Matrigel凝固。吸走小室中多余的液体，并在上室、下室分别加入100、600 μl无血清培养液，37℃平衡过夜。收集各处理组细胞，计数1×10⁵个细胞，用100 μl无血清培养液重悬，加入Transwell小室上室，在下室加入600 μl完全培养液。在37℃、5% CO₂孵育24 h后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定15min，PBS洗涤一次，结晶紫染色10 min，PBS洗涤一次，检测细胞是否穿过小孔，如有穿过则终止其他实验组，并拍照统计。

1.2.5 动物模型的构建

裸鼠，4~5周龄，体质量（20±2）g，雌性。取对数生长期的pSR-GFP/Neo-Mock-shRNA-5-8F细胞和pSR-GFP/Neo-CLU-shRNA-5-8F细胞制成浓度为2×10⁷个每毫升的细胞悬液（活细胞比率＞95.0%），每组各20只。用无血清基质10.0 ml，于1500 r/min，离心3 min，连续洗3次，最后用无血清基质混匀，用血球计数器计算肿瘤细胞数量，取细胞悬液0.2毫升/只，注射于裸鼠尾静脉，30 s内注射完毕。四周后，小鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠，0.4毫升/只，麻醉处死。剖腹取材，称取肝、肺、肾、脾等器官质量，观察并记录各器官肿瘤转移情况，实验结束取瘤称重后，4%多聚甲醛固定。肿瘤组织和各脏器制成石蜡切片，切片厚度3 μm。

1.2.6 HE染色和免疫组织化学检测CLU表达

取动物实验中获取的肿瘤标本，做HE染色和免疫组织化学检测。HE染色主要操作流程为：甲醛固定、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、苏木精-伊红染色、脱水、二甲苯透明，封片。免疫组织化学主要操作流程为：甲醛固定、石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、封闭、孵育一抗、二抗和辣根过氧化物酶标记的亲和素、DAB显色、苏木精对比染色、盐酸-酒精分化、脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观察并拍照。

1.2.7 Western blot检测相关蛋白表达

组织和细胞总蛋白应用蛋白裂解液进行提取，超声10 s，12 000 r/min离心20 min，收集上清液。应用BCA法进行蛋白定量，将待测样品上样后进行电泳。电转至PVDF膜后封闭，一抗（1:500，鼠抗人单克隆抗体CLU）、二抗（1:4 000，辣根过氧化物酶标记兔抗小鼠抗体），ECL荧光试剂盒进行曝光、显影、定影、压片。每种蛋白重复检测3次，以目的基因和GAPDH吸光度比值作为目的基因的相对表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，计量资料采用两样本t检验分析，多个样本计量资料的比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 CLU shRNA干扰质粒的构建

根据CLU编码基因的cDNA序列（Ge n -Bank Accession Number: NM_203339），参考文献中CLU shRNA靶点序列，设计本实验中的CLU s hRNA干扰序列，CLU- s hRNA：5’-GGAUGAAGGACCAGUGUGAdTdT-3’；Antisense-CLU-shRNA：5’-UCACACUGGUCCUUCAUCCdTdT-3’；并设计CLU shRNA的引物。用MluⅠ进行酶切鉴定。将上述干扰序列克隆送金唯智基因公司测序，将欲获得的序列与测序序列进行比对（图略）。测序结果经BLAST分析显示：基因CLU shRNA已成功克隆到载体pSRGFP/Neo中，原始序列与已知序列进行BLAST100%一致，因此，可以用于后续实验。

2.2 CLU在6-10B和5-8F细胞系中的表达

2.2.1 QRT-PCR分析CLU-mRNA在6-10B和5-8F细胞系中的表达

结果显示，CLU在5-8F细胞中的表达量为6-10B的2.99倍（P=0.00），选用5-8F细胞作为目的细胞进行RNA干扰，干扰后，5-8F细胞中的CLU-mRNA表达相对未干扰5-8F细胞显著降低（P=0.00），见图 1。

2.2.2 Western blot法验证CLU蛋白在6-10B，5-8F细胞系中的表达

结果显示CLU在5-8F中的高表达，在6-10B细胞中低表达（P=0.00），见图 2。与real-time PCR结果相符，故选择CLU表达量高的5-8F细胞系进行后续实验。

2.3 干扰质粒对鼻咽癌5-8F细胞的CLU干扰验证

为了进一步从蛋白水平明确CLU被干扰的效果，Western blot法检测其转染后不同组的蛋白表达水平。与非特异序列NC组（sh-mock）相比，转染干扰质粒的5-8F细胞（sh-CLU）的CLU蛋白表达显著下调（P=0.00），与real-time PCR 结果一致，见图 3。

2.4 鼻咽癌5-8F细胞中CLU基因的干扰对其迁移和侵袭功能的影响

为进一步明确CLU在5-8F细胞侵袭转移中的作用，采用CLU-shRNA沉默CLU的表达。实验分成3组：未处理的对照组（5-8F）、非特异序列NC组（sh-mock），转染干扰质粒的5-8F细胞组（sh-CLU）。培养24 h后，细胞侵袭和迁移检测结果显示，sh-CLU组的侵袭及迁移能力较5-8F对照组和sh-mock均显著降低（P<0.05），见图 4。说明CLU蛋白表达下调后，细胞的迁移和侵袭能力均受到抑制，提示CLU可能是抑制细胞转移的靶蛋白之一。

2.5 动物成瘤模型

实验分成2组：非特异序列NC组（sh-mock），转染干扰质粒的5-8F细胞（sh-CLU）。结果显示sh-mock细胞组对比sh-CLU细胞组，小鼠心、肝、脾、肾大小变化不显著，见图 5A，肺组织可见癌细胞广泛浸润，瘤体均为实体瘤，随着肿瘤的生长，形状逐渐呈不规则形，表面为结节状或分叶状突起，切面淡红色，部分包膜完整。瘤体称重结果显示，sh-CLU细胞组对比sh-mock细胞组，瘤体的重量显著降低（P=0.00），见图 5B~C。免疫组织化学及Western blot结果显示，sh-Mock细胞组肺癌样品中CLU表达显著高于sh-CLU细胞组（P=0.00），见图 5D~F。

3 讨论

Clusterin蛋白（丛生蛋白）是一种在多种组织及体液中普遍存在的异源二聚体硫酸化糖蛋白^[14]，广泛参与免疫调节、细胞黏附、细胞与细胞相互作用、细胞分化及转化调控、细胞周期调节、DNA修复、脂质转运等多项重要的机体活动。研究发现，在人类多种恶性肿瘤包括卵巢癌^[15]、淋巴瘤^[16]、乳腺癌^[17]、胃癌^[8]、肝癌^[9]、胰腺癌^[18]、结肠癌^[10]和前列腺癌^[19]中表达异常，且其表达水平与肿瘤转移密切相关^[11-12]。

2009年Chou等^[20]发现，在肺腺癌细胞中，富含CLU的细胞外形呈现纺锤形态，而含少量CLU的细胞外形为立方形态；提示CLU在上皮间质转化过程中发挥作用。进一步沉默CLU可抑制锌指转录因子（snail2）在肺腺癌中的表达从而影响E-钙黏蛋白（E-cadherin）表达，且细胞外信号调解蛋白激酶（extracellular signal regulated kinase,ERK）活性也显著降低。因此有理由相信CLU与EMT密切相关。在卵巢癌、结肠癌，肾癌转移等研究中，已发现CLU可通过介导MMP-9、VEGF等促进肿瘤转移^{[11, 15, 21]}。赵晓航等^[22]发现食管鳞癌中CLU蛋白的去糖基化修饰及其定位改变可能与肿瘤发生发展密切相关。

在头颈部肿瘤中，田秀芬等^[23]研究显示在喉鳞状细胞癌组织中CLU蛋白阳性表达水平高于喉正常黏膜组织。随着喉鳞状细胞癌病理分级、临床分期的增高，CLU阳性表达率有上升趋势。本研究首先利用real-time PCR和Western blot法检测具有不同转移潜能的鼻咽癌细胞株5-8F（高转移、高成瘤）及6-10B（低转移、低成瘤）中CLU蛋白的表达情况，初步发现CLU在mRNA和蛋白水平在5-8F细胞中的表达显著高于6-10B细胞，故推测CLU极可能是鼻咽癌转移的重要分子靶点，CLU的表达增强，进一步调控下游基因的转录、活化，这可能是鼻咽癌发生转移的机制之一。

本研究进一步利用RNA干扰技术抑制CLU基因在鼻咽癌5-8F细胞中表达，以此来研究该基因在特定细胞中的功能。将干扰序列转入5-8F细胞，通过real-time PCR和Western blot两种方法验证干扰效果，结果提示干扰效果作用明显。至此，成功地构建了可有效干扰鼻咽癌细胞中CLU表达的干扰重组质粒。本研究以基因干扰技术为前提，通过Transwell小室侵袭及迁移实验显示CLU干扰对5-8F细胞系侵袭及迁移功能有显著影响。

另有Flanagan等^[17]构建了过度表达CLU的乳腺癌MCF-7细胞系（MCF-7CLU），将MCF-7和MCF-7CLU移植到6周龄的去势雌性小鼠，结果发现植入MCF-7细胞系的肿瘤生长缓慢，而植入MCF-7CLU细胞系的肿瘤生长迅速，且在癌症早期便出现肺转移和淋巴转移；证实CLU在肿瘤生长、转移方面发挥了显著作用。本研究以鼻咽癌5-8F（高表达CLU）和pSR-GFP/Neo-CLU-shRNA-5-8F为研究对象，通过3次尾静脉注射构建高转移模型，发现pSR-GFP/Neo-CLU-shRNA-5-8F细胞的转移能力明显降低，细胞成瘤质量显著下降。应用Western blot方法发现肿瘤细胞中，CLU的表达有明显的差异，随着转移能力的下降，CLU的表达明显减少，提示CLU在鼻咽癌细胞的体内成瘤及转移作用同样存在，与其他研究结果一致。至此，在动物体内实验中证实CLU在促进鼻咽癌的肿瘤转移、生长方面发挥了重要的作用。

以上结果分别从体外细胞，动物体内证实了CLU对5-8F细胞系侵袭及迁移功能的影响，未涉及临床组织和血清标本的研究。在临床组织及血清标本中，2010年Redondo等^[24]用免疫组织化学法分析103例大肠癌患者手术标本，结果显示：57例无肿瘤复发患者中21%患者CLU过表达；46例肿瘤复发，患者中41%CLU过表达；另有Pucci等^[25]检测了异种移植结肠癌细胞成功的裸鼠接种前后血清CLU浓度，发现血清CLU浓度与肿瘤大小明显呈正相关，推测肿瘤细胞能够分泌释放CLU。上述研究提示通过检测CLU可以预测肿瘤复发或预后。本研究细胞及动物实验的结果为进一步研究鼻咽癌的临床组织及血清标本中CLU表达侵袭及转移的分子机制打下了实验基础，其相关蛋白有可能成为抑制肿瘤转移的分子靶标及预测肿瘤复发或预后的重要标志。