0 引言

阿霉素（doxorubicin,DOX）是目前临床使用最广泛的光谱抗癌化疗药物之一，但由于有较大的心脏毒性，严重限制了其在临床上的使用^[1]。开发新型的DOX给药途径是目前研究的重中之重，有功能性的脂质体成为研究的热点。其中长循环热敏脂质体（long-circulating thermo-sensitive liposomes,LCTSLs）作为一种优秀的治疗载体，近年来被广泛研究^{[2, 3]}。LCTSLs即具有脂质体本身的优点，还具有体内长循环特性及温度敏感控释特性。温度控释是近年来研究较广泛的一种控释技术，其利用外界刺激通过温度的变化释放药物，最主要的外界刺激手段有近红外光（near-infrared,NIR）^[4]、微波^[5]、交变磁场^[6]、射频^[7]等。本研究使用临床上已广泛使用的射频（radio frequency,RF）热疗技术与DOX-LCTSLs联合治疗人宫颈癌HeLa荷瘤裸鼠，从药效学方面全面评价此种疗法的抗肿瘤作用。

1 材料与方法 1.1 仪器与材料

盐酸阿霉素（DOX，上海晶纯生化科技股份有限公司）、DMEM培养液（美国Hyclone公司）、胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）、二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC，上海笛柏化学品技术有限公司)、胆固醇及DSPE-PEG2000（国药集团化学试剂有限公司）、人宫颈癌HeLa细胞系（上海复祥生物科技有限公司）、雌性裸鼠（4~6周龄，20~22 g，购自湖南斯莱克景达公司）、SR1000型射频热疗机（深圳先科医疗设备有限公司）。

1.2 阿霉素长循环热敏脂质体的制备

本实验室采用逆向蒸发法制备出DOX-LCTSLs^[8]，最终测得其包封率为88.5%，粒径为（190.7±4.8）nm。具体实验步骤如下：准确称量DPPC 16 mg、胆固醇4 mg、DSPE-PEG2000 2 mg（8:2:1质量比）溶于5 ml氯仿并置于茄形瓶中。将DOX水溶液（1 mg/ml）加入上述脂质溶液中，超声乳化2 h得到w/o乳剂后旋转蒸发，减压除去有机溶剂得到脂质体的水性混悬液。使用孔径为0.1 μm的超滤管离心去除游离DOX，得DOX-LCTSLs溶液。使用激光纳米粒度仪测定其粒径，并使用高效液相法测定其包封率。

1.3 HeLa荷瘤裸鼠模型构建

取对数生长期的HeLa人宫颈癌细胞，胰蛋白酶消化，将细胞悬液浓度调整至2×107个每毫升。将每只BALB/c裸鼠（雌性，4~6周，18~22 g）右上肢背部皮下接种200 μl细胞悬液，隔日观察并测量肿瘤的长径（A:单位mm）和短径（B:单位mm），根据下列公式计算肿瘤体积：肿瘤体积V=（A×B2）/2。当肿瘤体积达到100 mm3以上时，认为肿瘤模型接种成功。

1.4 体内分布考察

将裸鼠随机分为2组：DOX组和DOX-LCTSLs组，每组24只（4个时间点，每个时间点6只），DOX的最终给药浓度为5 mg/kg。分别在给药后0.5、1、4及12 h，每组于每个时间点摘除裸鼠眼球取血约0.5 ml后处死裸鼠，取心、肝、脾、肺、肾及肿瘤组织称重，将其放入0.9%氯化钠溶液中冰浴下以超声波细胞粉碎机匀浆，瘤组织: 0.9%氯化钠溶液=1:3（W/W）。然后将匀浆液与4倍体积的有机溶剂（氯仿:甲醇=4:1）混合，涡旋3 min，12 000 r/min的转速离心15 min，取出有机溶剂层室温挥干。每个样品中加入100 μl甲醇，超声后8 000 r/min的转速离心10 min，取上清液通过HPLC法检测DOX浓度。HPLC条件为：安捷伦C18柱（150 mm×4.6 mm,5.0 μm）；甲醇:0.01 mol/L的磷酸二氢钾缓冲液:冰醋酸（68:31.5:0.5）；柱温30℃; 荧光检测波长:激发波长为480 nm、发射波长为550 nm。

1.5 荷瘤裸鼠给药

将裸鼠随机分为6组：对照组、RF热疗组、DOX组、DOX-LCTSLs组、DOX+RF组和DOX-LCTSLs+RF组，每组6只。对各组裸鼠进行尾静脉注射，对照组和RF热疗组注射0.9%氯化钠溶液（0.2毫升/只/次）；DOX组、DOX-LCTSLs组、DOX+RF组和DOX-LCTSLs+RF组DOX的最终给药浓度为5 mg/kg。每隔2日给药1次，共给药5次。RF热疗为给药4 h后进行（小鼠使用铜网包裹仅露出肿瘤部位，300 W，30 min）。最后一次治疗1天后将裸鼠脱颈处死，取各组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾和瘤组织分为两部分，一部分制作石蜡切片进行HE染色，一部分进行TUNEL凋亡检测。

1.6 行为观察、体质量及抑瘤率检测

每次注射前称重，绘制体质量变化曲线。注射后观察各组裸鼠的行为状态，测量肿瘤并计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（1-实验组肿瘤体积/对照组肿瘤体积）×100%。

1.7 HE染色

将新鲜组织使用12%的中性福尔马林固定24 h，后经脱水、包埋、切片、脱蜡、染色、封片，放于显微镜下采集图片。

1.8 TUNEL法检测肿瘤凋亡

取瘤体组织石蜡切片，按常规方法进行脱蜡、水合、PBS漂洗，然后加入蛋白酶K工作液消化30 min，PBS漂洗，使用H2O2封闭液封闭10 min，加入TUNEL反应液，避光反应1 h，PBS漂洗，DAB显色。同时设立阳性对照及阴性对照组。将制备好的TUNEL染色玻片放置于显微镜下采集图片。

1.9 统计学方法

应用SPSS19.0统计软件对结果进行数据处理，结果采用(x± s)表示，采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 DOX的组织分布

结果显示，DOX-LCTSLs与DOX具有不同的体内分布情况。与DOX相比，不同时间段内DOX-LCTSL在心脏和肾脏中的分布均明显减少，其中DOX组在心脏中的分布约为DOX-LCTSLs组的4倍；DOX-LCTSLs组在肺部中的分布均明显增多；除了在0.5 h时单纯DOX组的分布浓度较高，其他时间点均显著低于DOX-LCTSLs组。在肿瘤部位的分布显示，DOX-LCTSLs在给药4 h后的浓度最高，且与DOX相比差异具有统计学意义（P=0.048），见图 1。

2.2 荷瘤裸鼠行为及体质量变化

对照组、RF热疗组、DOX组、DOX-LCTSLs组、DOX+RF组和DOX-LCTSLs+RF组裸鼠在进行尾静脉注射后，对其进行临床观测发现0.9%氯化钠溶液组及DOX-LCTSLs组裸鼠表现正常；DOX组在注射后10 min内有不同程度的不安，30 min后开始行为正常，整个治疗过程中出现不同程度的精神萎靡、皮毛不顺滑情况；进行RF热疗的小鼠，在治疗期间均有不同程度的躁动。从治疗前后的体质量变化情况可以看出，DOX组和DOX+RF组体质量变化较明显，见表 1。以上结果表明，DOX-LCTSLs可以在一定程度上降低DOX对裸鼠的毒性作用。

2.3 抑瘤率考察

根据各组肿瘤体积计算抑瘤率，见表 2。结果表明，热敏长循环脂质体联合射频热疗可有效抑制肿瘤生长，DOX-LCTSLs+RF组与RF组、DOX组、DOX-LCTSLs组及DOX+RF组相比P值分别为0.001、0.007、0.014、0.027，表明各组与DOX-LCTSLs+RF组相比差异均有统计学意义（P＜0.05）。实验结果对比可知，将化疗与RF热疗联合治疗具有明显的协同增强作用。

2.4 裸鼠主要器官HE染色结果

HE染色结果表明，Control组各脏器的细胞排列紧密、细胞体大、细胞形态完整。与Control组相比，其余5组裸鼠的肝、脾、肺、肾的HE染色切片无明显不同，但是DOX组和DOX+RF组的心脏HE切片结果表明这两组对心肌组织具有明显的毒性，心肌细胞呈现不规则排列，出现细胞核溶解，见图 2。肿瘤组织HE切片结果显示，与Control组相比，其他各组均有不同程度变化。其中DOX-LCTSLs+RF组出现明显的细胞结构消失及细胞核溶解。

2.5 肿瘤组织凋亡检测

TUNEL法染色图片中凋亡细胞的形态特征为胞体缩小，胞核浓染呈棕色。结果显示Control组细胞体态完整，呈蓝色或深蓝色；RF组镜下出现少量凋亡细胞，DOX组凋亡细胞较Control组多，DOX-LCTSLs组、DOX+RF组和DOX-LCTSLs+RF组与前几组明显不同，呈棕色的凋亡细胞急剧增多，且多个镜下的DOX-LCTSLs+RF组凋亡细胞个数比DOX+RF组和DOX+RF组明显增多，见图 3。此结果证明，单纯的RF热疗可以少量引起肿瘤细胞凋亡，DOX-LCTSLs+RF组的凋亡效果比其他所有组效果都要明显，可以证明DOX-LCTSLs与RF热疗联合可有效促进细胞凋亡。

3 讨论

心脏毒性是阻碍DOX临床应用的主要原因，因此降低DOX的毒性、提高DOX在靶器官或肿瘤中的浓度是提高其疗效的关键^[9]。DOX脂质体目前已获美国食品药品监督管理局认证^[10]。但是，单纯的DOX脂质体不具有控释作用，在到达肿瘤靶部位时不能有效释放药物。为了解决以上问题，本研究构建了一种通过RF热疗激发控释的LCTSLs并考察其在裸鼠体内的分布及其他行为。

RF是目前临床常用的抗肿瘤新型疗法，采用非接触式的治疗方式，利用射频波将组织加热到能杀灭肿瘤细胞的温度^[11]。本研究利用RF的热疗作用，一方面用于在达到变相温度后迅速释放LCTSLs中包裹的DOX，另一方面利用热疗本身对肿瘤的杀伤作用及DOX的热疗敏感度联合增强对肿瘤的治疗。Wang课题组前期通过利用单壁碳纳米管的热疗作用与DOX化疗联合治疗MCF-7细胞及荷瘤裸鼠的实验结果表明，近红外热疗与化疗联合可有效抑制MCF-7肿瘤在体内和体外的发生及发展^[12]。Shi课题组利用化学修饰的石墨烯荷载DOX，同时也证明了NIR热疗与化疗联合作用对肿瘤的抑制作用^[13]。但是目前研究较多的NIR热疗具有一定的局限性，即NIR仅可用于浅表肿瘤，因此本课题选用了可穿透深层组织的RF热疗，这对深层肿瘤的防治具有很强的研究意义。

本课题体内分布实验证明，DOX-LCTSLs可有效维持治疗期间DOX在体内的血药浓度及在肿瘤部位的药物浓度，可有效降低DOX在心脏部位的分布。其结果在后期的HE染色切片中表现的更为确切，DOX-LCTSLs组的心脏HE切片表明，心脏细胞及组织形态无明显变化，而DOX组的心脏HE切片表现出明显的毒性。通过对荷瘤裸鼠肿瘤的抑制率及凋亡情况的考察，发现DOX-LCTSLs与其他实验组相比具有明显的肿瘤抑制作用（肿瘤抑制率达82.14%）及促细胞凋亡作用。这些实验结果都证明了，本实验构建的给药系统具有维持血药浓度、降低化疗毒性、提高肿瘤抑制效果的功能。将DOX-LCTSLs与热疗联合具有很强的研究价值，值得进一步的研究探索。