2016, Vol. 43文章信息
- miR-138靶向调控PDK1基因抑制人结肠癌SW620细胞侵袭
- Role of miR-138 in Invasion of Human Colon Cancer Cells SW620 by Regulating PDK1 Expression
- 肿瘤防治研究, 2016, 43(5): 340-344
- Cancer Research on Prevention and Treatment, 2016, 43(5): 340-344
- http://www.zlfzyj.com/CN/10.3971/j.issn.1000-8578.2016.05.005
- 收稿日期: 2015-07-31
- 修回日期: 2015-12-10
引用本文 |
结直肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，由于生活习惯和饮食结构的改变，其发病率和死亡率逐年升高。手术和化疗是结直肠癌的常规治疗手段，但是对于中晚期结直肠癌患者，手术效果差，化疗面临耐药问题，因此，探寻治疗结直肠癌的新方法探索其发病机制在当前是迫切的。丙酮酸脱氢酶激酶-1（pyruvate dehydrogenase kinase-1,PDK1）是细胞糖酵解关键限速酶丙酮酸脱氢酶的调节酶，在其磷酸化过程中发挥重要的功能。研究发现PDK1除具有糖代谢酶的催化活性，对拮抗细胞凋亡还有一定的影响，药物抑制PDK1可诱导肿瘤细胞凋亡[1]。体外细胞培养显示PDK1在头颈部癌、非小细胞肺癌、乳腺癌等细胞中表达增高[2-4]。MicroRNA（miRNA）是一类非编码RNA，长度大约为21~25 nt，通过与靶基因mRNA 3'端非翻译区（3'UTR）互补，降解目的基因并下调其表达[5]，以此参与疾病发生过程中基因表达的调控。
本研究应用生物信息学对miR-138-5p（简称：miR-138）和PDK1基因的靶向匹配关系进行预测并通过双荧光素酶报告基因系统鉴定；转染miR-138模拟物进入人结肠癌SW620细胞后，qRT-PCR和Western blot检测转染后miR-138和PDK1的表达，阐明miR-138对PDK1基因表达的调控作用；Transwell小室检测癌细胞体外的侵袭性，拟从分子水平上揭示miRNA对肿瘤生物学行为的影响。
1 材料与方法 1.1 材料HG-DMEM和RPMI 1640培养液、胎牛血清（FBS）和胰蛋白酶购于美国Hyclone公司，兔抗人PDK1抗体购于美国Santa Cruz公司，人结肠癌SW620细胞购于上海生物细胞研究所。
1.2 SW620细胞培养及免疫荧光检测PDK1表达SW620细胞在25 cm2培养瓶内，于37℃、5%CO2培养箱中培养，每2~3 d换一次液，待细胞达到80%融合后，用0.25%胰酶和0.02%EDTA消化并传代。取适量细胞涂片，10%甲醛固定后，0.1%BSA封闭1 h，加兔抗人PDK1抗体，室温孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min，二抗加TRITC标记山羊抗兔IgG抗体（1:200），DAPI复染细胞核。
1.3 生物信息学预测应用靶基因预测软件miRanda和TargetScan对miR-138和PDK1基因的靶向匹配关系进行预测。
1.4 miR-138靶基因PDK1的鉴定 1.4.1 PDK1 3’UTR的克隆向SW620细胞加入TRIzol提取总RNA，利用反转录试剂盒（TaKaRa）反转录为cDNA，应用正向引物5' ccgagctcatttgtccaccagcatta 3’和反向引物5' gctctagaaagccagccagtatttta 3’扩增PDK1 3’UTR，电泳检测PCR产物，并克隆到pMD 18-T 载体（TaKaRa）上，测序。PDK1 3’UTR突变体（3’UTRmu）的构建严格按照定点突变试剂盒（QuickChange site-directed mutagenesis kit，Stratagene）要求完成。
1.4.2 PDK1 3’UTR-pmirGLO载体的构建应用XbaⅠ和SacⅠ双酶切pmirGLO质粒（Promega）、PDK1 3’UTR以及3’UTRmu片段，应用DNA 连接试剂盒（TaKaRa）连接酶切片段，构建荧光素酶报告载体，转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞（TaKaRa）中扩增，应用质粒提取试剂盒（Axygen）从菌液中提取重组质粒。
1.4.3 荧光素酶检测BMSCs细胞培养在含10% FBS的DMEM培养液中，胰酶消化细胞并铺板，密度达到90%~95%进行转染。对于每孔细胞，应用脂质体2000（Invitrogen）转染PDK1 3’UTR-pmirGLO或3’UTRmu-pmirGLO 200 ng以及miR-138模拟物（GenePharma）或对照miRNA 30 nM，24 h后根据Dual-Luciferase®报告基因检测系统（Promega）说明检测荧光强度。
1.5 qRT-PCR检测miR-138及PDK1的表达取转染miR-138模拟物的SW620细胞以及空白对照组细胞，分别加入TRIzol或RNAiso for small RNA（TaKaRa）提取总mRNA或总miRNA，反转录得到cDNA，稀释4倍后加入SYBRR Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa）和引物，见表 1。在实时定量PCR仪上进行40个循环的PCR反应，应用软件对反应结果进行定量分析。
1.6 Western blot检测PDK1蛋白表达量
取转染miR-138模拟物的SW620细胞以及空白对照组细胞，分别加入RIPA裂解液超声破碎，4℃离心25 min，用BCA法测定蛋白含量。SDS-PAGE分离样品并转膜，4%BSA封闭1 h后加入兔抗人PDK1抗体（1:200），4℃过夜后，滴加二抗（1:1 000），4℃摇床1 h，应用凝胶成像系统ECL发光显影。
1.7 Transwell检测SW620细胞体外侵袭将转染miR-138模拟物的SW620细胞以及空白对照组细胞加入无血清培养液置入Transwell上室中，下室加入含10%FBS的RPMI 1640培养液，24 h后取出小室，用甲醇固定小室反面细胞20 min，于结晶紫染液中染色15 min。光学显微镜下取3个随机视野计算穿膜细胞数。
1.8 统计学方法应用SPSS 13.0统计软件处理数据，以均数±标准差（x± s）表示，组间比较进行t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 SW620细胞形态学观察倒置相差显微镜下可见人结肠癌SW620细胞均匀分布，形态规则均一，见图 1A；细胞免疫荧光显示细胞内有PDK1蛋白的表达，显示红色荧光，见图 1B~1D。
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| A: light microscope observation of SW620 cells (×200); B: immunofluorescent staining of PDK1 (×400); C: DAPI staining of cell nuclei (×400);D: merge (×400); DAPI: 4'6-cliamidino-2-phenylindde 图 1 SW620细胞光学显微镜和免疫荧光观察 Figure 1 Light microscope observation and immunofluorescent staining of SW620 cells |
2.2 miR-138和PDK1的匹配关系
为寻找miR-138和PDK1（NM_002610 ）基因的靶向匹配关系，分别运用TargetScan和miRanda进行预测，TargetScan显示miR-138在PDK1 mRNA 3’UTR上有一个保守的靶位点，其类型为8 mer，匹配得分为93。miRanda结果表明，miR-138与靶位点的mirSVR得分为-0.7625，二者均表明miR-138与PDK1匹配良好，见表 2。
2.3 miR-138可下调PDK1的表达
双荧光素酶报告基因系统检测结果显示如果将对照组（control）PDK1 3’UTR-pmirGLO的荧光素酶表达水平设定为1，miR-138能使其荧光素酶表达水平下降为（48.31±4.97）%，差异有统计学意义（t=2.467,P=0.013），见图 2。而control组3’UTRmu-pmirGLO的荧光素酶表达水平是3’UTR 的（1.07±0.05）倍，转染miR-138模拟物后，其表达水平为（1.13±0.07）倍，两者与control组相比差异均无统计学意义。由此可见，miR-138通过靶向作用于PDK1 mRNA 3’UTR能够负性调控PDK1基因的表达。
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| The luciferase activity of 3’UTR in control group was used as control and arbitrarily defined as 1; *: P＜0.05, compared with control group 图 2 miR-138组和对照组荧光素酶相对活性 Figure 2 Relative luciferase activity of miR-138 group and control group |
2.4 转染后miR-138和PDK1基因的相对表达
应用qRT-PCR对转染miR-138模拟物的SW620细胞进行检测，发现如果将空白对照组（control）SW620细胞miR-138的表达量设定为1，则转染组（mimics）细胞是control组的（23.89±9.62）倍，差异有统计学意义，见图 3A。如果将control组PDK1 mRNA的表达量设定为100%，转染后发现PDK1 mRNA的表达量下降至（49.93±6.09）%，差异有统计学意义，见图 3B。结果表明过表达miR-138能够导致PDK1 mRNA表达的下降，与荧光素酶报告系统检测结果相符。
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| The expression of miR-138 and PDK1 mRNA were normalized to U6 and Gapdh respectively. The gene expression of control group was arbitrarily defined as 1 or 100%; *: P＜0.05, compared with control group 图 3 转染后miR-138和PDK1 mRNA的相对表达 Figure 3 Relative expression level of miR-138 and PDK1 mRNA after transfection |
2.5 转染后PDK1蛋白的表达量
应用Western blot对转染miR-138模拟物的SW620细胞进行检测，条带结果显示转染组（mimics）PDK1蛋白表达量较空白对照组（control）明显降低，见图 4，表明miR-138的过表达能够抑制SW620细胞PDK1蛋白的生成，提示miR-138通过靶向作用于PDK1 mRNA 3’UTR能够负性调控PDK1基因的表达。
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| 图 4 转染miR-138模拟物后PDK1蛋白的表达 Figure 4 Expression level of PDK1 protein after transfection of miR-138 mimics |
2.6 miR-138抑制SW620细胞的侵袭
Transwell小室检测SW620细胞的体外侵袭能力，发现转染组（mimics）的穿膜细胞数（58.41±9.92）较空白对照组（171.23±15.87）明显降低，差异有统计学意义（t=2.120,P=0.025），见图 5。结果表明miR-138的过表达能够抑制SW620 细胞的体外侵袭能力。由此可见，miR-138通过靶向作用于PDK1基因能够抑制SW620细胞的侵袭。
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| A: control; B: mimics 图 5 Transwell检测SW620细胞的侵袭力 Figure 5 Invasion of SW620 cells detected by Transwell assay |
3 讨论
PDK1与细胞的代谢、增殖和凋亡有关，在细胞信号转导通路中起关键作用。有研究证明结直肠癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤和甲状腺癌等恶性肿瘤与PDK1介导的信号通路异常有关[6-8]。Carón等[9]研究发现PDK1在结直肠癌HCT116细胞系中的活性较高，通过阻断PI3K/PDK1/Akt信号通路，不仅能够抑制癌细胞增殖，并能增加细胞对放疗的敏感度。Arico等[10]研究发现通过抑制结直肠癌HT-29细胞系中PDK1基因的表达，能够诱导肿瘤细胞发生凋亡。以上两个研究均表明，结直肠癌细胞的增殖和药物诱导的癌细胞凋亡与PDK1及其介导的信号转导通路有关。本研究发现光学显微镜下可见人结肠癌SW620细胞均匀分布，形态规则均一；细胞免疫荧光显示细胞内有PDK1蛋白的表达，显示红色荧光。
MicroRNA已被证实与结肠癌密切相关，且能够靶向调控癌症相关转录因子影响癌细胞的生物学行为。Akao等[11]发现let-7在结肠癌组织中表达降低，阻断RAS和C-myc信号通路，能够抑制癌细胞生长。Tazawa等[12]发现miR-34a通过调节E2F和p53信号通路抑制癌细胞增殖，表明miR-34a与结肠癌关系密切。Nagel等[13]发现miR-135通过抑制APC基因表达，进而调控Wnt/β-catenin信号通路，促进结肠癌细胞侵袭。最近，Wang等[14]研究发现黄曲霉素B1能够诱导气道上皮BEAS-2B细胞发生恶性转化，在此过程中，miR-138-1表达异常，miR-138-1的过表达能够抑制BEAS-2B细胞的增殖、侵袭和迁移，进一步通过荧光素酶实验发现miR-138-1的靶基因为PDK1，提示miR-138-1通过负性调控PDK1的表达对黄曲霉素B1诱导的BEAS-2B细胞的恶性转化有重要作用。
本研究运用生物信息学方法对miR-138和PDK1基因的靶向匹配关系进行预测，发现二者匹配良好，进一步通过双荧光素酶报告系统鉴定，发现miR-138能够靶向作用于PDK1 3’UTR抑制PDK1的表达。转染miR-138模拟物后，qRT-PCR和Western blot结果表明过表达miR-138能够导致PDK1 mRNA和蛋白表达的下降，进一步应用Transwell小室检测SW620 细胞的体外侵袭能力，发现miR-138的过表达能够抑制SW620 细胞的侵袭能力，提示miR-138通过靶向作用于PDK1基因能够抑制SW620细胞的侵袭。
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