0 引言

胃癌是常见的恶性肿瘤之一，虽然近年其发病率有所下降，但是胃癌仍占全世界恶性肿瘤的第四位^[1]，且大多数的胃癌患者确诊时已属晚期，失去了手术根治的机会^[2]。化疗作为晚期胃癌治疗的主要手段^[3]，可以延长患者生存期，提高生存率，但不良反应明显，目前仍未有突破性进展。因此，在目前已有的治疗方法下，迫切需要我们研究出新型抗癌药物。

中药香加皮主产于河北、河南等地，为萝科植物杠柳的根皮，含有甾醇、甙类、酯类等多种化合物成分，具有强心、利尿、驱虫、升压等作用^[4]。本课题组前期研究发现，香加皮醇提物杠柳苷对食管癌细胞TE-13、乳腺癌细胞MCF-7^[5]和结肠癌细胞SW480等^[6]的增殖均具有良好的抑制效应，但对其作用机制尚不清晰。本研究以胃癌MGC-803细胞为研究对象，观察香加皮杠柳苷对MGC-803细胞的增殖抑制及诱导凋亡的作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

人胃癌细胞株MGC-803细胞购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，由河北医科大学第四医院科研中心保存。香加皮杠柳苷由华北制药集团新药研究开发有限责任公司制备，纯度≥96%，经无水乙醇溶解后，用无牛清培养液稀释到所需浓度（200、100、50 ng/ml）。RPMI 1640培养粉购自美国GIBCO/BRL公司，胎牛血清购自杭州四季青生物有限公司，胰蛋白酶购自北京索莱宝科技有限公司，TUNEL试剂盒购自美国Promega公司，兔抗人Caspase-3、Caspase-9和Cathepsin B单克隆抗体购自美国Abcam公司，IRDye 800标记的羊抗兔IgG（二抗）购自美国Rockland公司，吖啶橙购自北京索莱宝科技有限公司，MTS[3-(4,5-dimethylthiazol-zyl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazoliuzolium,inner salt]购自Promega公司，异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）标记的山羊抗兔IgG（二抗）购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞培养

MGC-803细胞用含10%胎牛血清、100 u/ml青霉素和100 μg/ml链霉素RPMI 1640培养液，在37℃、5%CO₂条件下培养，每2~3 d用0.25%胰蛋白酶消化、传代，取对数生长期细胞用于实验。

1.3 MTS法检测细胞抑制率

取对数生长期MGC-803细胞，制成1×10⁵/ml细胞悬液，接种于96孔板中，每孔90 μl，待细胞贴壁后，实验分为两组：（1）药物处理组，分别加入500、1 000、2 000 ng/ml香加皮杠柳苷10 μl，使其终浓度为50、100、200 ng/ml；（2）空白对照组，未加入香加皮杠柳苷处理。每组设三个复孔。37℃、5%CO₂条件下，药物作用于胃癌细胞24、48 h后，每孔加入10 μl MTS，继续培养2.5 h后用酶标仪测490 nm波长时各孔吸光度（OD）值。细胞增殖率（%）=OD值_实验组/OD值_对照组×100%。

1.4 TUNEL法检测细胞凋亡

取对数生长期MGC-803细胞，接种于6孔板中，各孔事先放入清洗干净的盖玻片，待细胞贴壁后，吸出培养液。实验分为三组：（1）香加皮杠柳苷药物组，加入香加皮杠柳苷（50、100、200 ng/ml）1 ml处理MGC-803细胞；（2）空白对照组，未加入香加皮杠柳苷处理的MGC-803细胞；（3）阳性对照组，加入2%DMSO 1 ml处理MGC-803细胞。按照TUNEL试剂盒说明书进行试验。弃去培养液，4%多聚甲醛固定25 min，PBS漂洗，0.2%Triton X-100通透5 min，PBS漂洗，Equilibration Buffer浸润5 min，TdT mix 37℃，潮湿环境浸润60 min，2×SSC浸润15 min，PBS漂洗，0.3%H₂O₂浸润5 min，PBS漂洗，HRP浸润30 min，PBS漂洗，DAB显色。镜下观察阳性细胞的细胞核呈棕黄色，染色质凝聚、浓缩，呈凋亡细胞的形态学征象。每张切片随机选取10个视野（×400），计数凋亡细胞，凋亡率=（视野内凋亡细胞个数/视野内所有细胞个数）×100%。

1.5 蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白的表达

取对数生长期MGC-803细胞，接种于6孔板中，待细胞贴壁后，吸出培养液，实验分为两组：（1）香加皮杠柳苷药物组，加入香加皮杠柳苷（50、100、200 ng/ml）1 ml处理MGC-803细胞；（2）空白对照组，未加入香加皮杠柳苷处理的MGC-803细胞。37℃、5%CO₂条件下作用24 h后，提取总蛋白，BCA试剂盒测蛋白浓度。取60 μg蛋白进行12%SDS-PAGE电泳后，湿转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭1 h，孵一抗4℃过夜（Caspase-3、Caspase-9和GAPDH的稀释比例为1:1 000 ），洗膜，孵IRDye 800标记的二抗1 h（稀释比例为1:10 000），洗膜，Odyssey双色红外荧光扫描系统进行检测分析。

1.6 吖啶橙染色检测细胞溶酶体的释放

取对数生长期MGC-803细胞，接种于6孔板中，待细胞贴壁后，吸出培养液。实验分为三组：（1）香加皮杠柳苷药物组，MGC-803细胞加入香加皮杠柳苷（100 ng/ml）1 ml；（2）空白对照组，未加入香加皮杠柳苷处理的MGC-803细胞；（3）阳性对照组，加入0.03%的H₂O₂处理MGC-803细胞。将三组细胞置于37℃、CO₂体积分数为5%条件下处理24 h后，弃去培养液，PBS漂洗一次，加入1 ml 0.01%吖啶橙染色1 min，弃去染液，加入1 ml PBS。绿色激发光下可观察到红色荧光颗粒，阳性细胞溶酶体崩解呈现粗大颗粒，正常细胞为细小颗粒。

1.7 免疫荧光法检测蛋白水解酶Cathepsin B的释放

取对数生长期MGC-803细胞，接种于6孔板中，待细胞贴壁后，吸出培养液，实验分为两组：（1）香加皮杠柳苷药物组，MGC-803细胞加入香加皮杠柳苷（100 ng/ml）1 ml；（2）空白对照组，未加入香加皮杠柳苷处理的MGC-803细胞。将两组细胞置于37℃、5%CO₂条件下处理24 h后，PBS漂洗1次，4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗，0.3%Triton X-100透膜10 min，PBS洗3次，10%BSA 37℃封闭30 min，湿盒中孵育2%BSA稀释的Cathepsin B抗体（稀释比例为1:100）4℃过夜，PBST洗3次，湿盒中孵育2%BSA稀释的FITC标记的羊抗兔二抗（稀释比例为1:200）1 h，PBST洗3次，加入10%PI 10 μl，荧光显微镜下观察，经PI染色后的细胞核呈现红色荧光，Cathepsin B表达阳性的位点呈现绿色荧光。融合图片中的绿色位点位于细胞核的外部，即可判断Cathepsin B释放到了细胞质中。

1.8 统计学方法

采用SPSS13.0软件进行统计学分析，所有实验均独立重复3次，各组数据以（x± s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果 2.1 香加皮杠柳苷抑制MGC-803细胞增殖

50、100、200 ng/ml香加皮杠柳苷作用于MGC-803细胞24、48 h后，24 h增殖率分别为[(66.43±1.67)%、(55.39±3.63)%、(37.06±0.57)%]，48 h增殖率分别为[(38.16±3.26)%、(32.00±1.83)%、(24.75±1.57)%]。与空白对照组相比，香加皮杠柳苷对MGC-803细胞的增殖有抑制作用，差异有统计学意义（F=150.703，P=0.000；F=163.808，P=0.000），见图 1。

2.2 香加皮杠柳苷诱导胃癌细胞凋亡

与空白对照组比，50、100、200 ng/ml香加皮杠柳苷作用于MGC-803细胞24 h后，凋亡率分别为(28.56±6.96)%、(33.70±4.60)%、(60.42±4.48)%，2% DMSO组凋亡率为(73.29±9.49)%，空白对照组凋亡率为(2.23±1.03)%。药物处理组凋亡率明显高于空白对照组，差异有统计学意义（F=75.217，P=0.000），见图 2。

2.3 香加皮杠柳苷对MGC-803细胞Caspase-3/9的影响

与空白对照组相比，50、100、200 ng/ml香加皮杠柳苷处理组的细胞中Caspase-3活性裂解片段（17 kDa）和Caspase-9（35 kDa）相对表达量明显增高，且差异均有统计学意义（F=155.870，P=0.000；F=19.541，P=0.000），见图 3。

2.4 香加皮杠柳苷对MGC-803细胞溶酶体膜完整性的影响

与空白对照组相比，100 ng/ml香加皮杠柳苷作用于MGC-803细胞24 h后，H₂O₂组和100 ng/ml组细胞均出现粗大颗粒，而空白对照组细胞中的溶酶体由于未发生裂解呈现为细小颗粒，表明细胞经香加皮杠柳苷处理后，其溶酶体发生裂解，释放出大量组织蛋白酶等，呈现颗粒状，见图 4。

2.5 香加皮杠柳苷对MGC-803细胞Cathepsin B释放的影响

与空白对照组相比，100 ng/ml香加皮杠柳苷作用于MGC-803细胞24 h后，细胞中Cathepsin B的表达明显升高，且释放到细胞质中，表明溶酶体发生裂解而释放了Cathepsin B，见图 5。

3 讨论

香加皮系萝科植物，主产于我国的东北和华北地区，具有抗炎、强心等作用，在临床上主要用于治疗风湿性关节炎和冠心病等^[7]。近年来研究发现，香加皮有较强的抗肿瘤活性^[8]。杠柳苷是从香加皮正丁醇萃取部分纯化得到的抗肿瘤单体化合物，对多种肿瘤细胞株增殖具有较强的抑制作用。本研究发现，50、100、200 ng/ml香加皮杠柳苷作用24、48 h，均可抑制胃癌细胞MGC-803的增殖。TUNEL染色法分析结果显示，药物处理组的细胞凋亡率明显高于空白对照组，且Caspase-3和Caspase-9作为促凋亡因子^[9-10]表达的升高，说明香加皮杠柳苷可诱导胃癌细胞凋亡。

细胞凋亡是由基因控制的细胞自主有序的死亡，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等作用，且有多种途径可以诱导细胞凋亡，主要有线粒体凋亡途径及死亡受体途径等。随着近几年对溶酶体研究的深入，发现溶酶体途径也可诱导细胞凋亡，其可通过线粒体途径和非线粒体途径^[11]，增加溶酶体膜的通透性，致使其内大量组织蛋白酶释放到细胞质，从而导致细胞的凋亡^[12]。Cathepsin B为位于溶酶体内的一种半胱氨酸蛋白酶超家族的重要成员之一，其主要生物学活性是参与细胞内某些前体蛋白的修饰，且其与细胞凋亡有密切关系^[13]。当溶酶体膜遭到破坏时，Cathepsin B由溶酶体内释放到细胞质中介导细胞凋亡^[14]。本研究通过吖啶橙染色证实经香加皮杠柳苷处理后的胃癌细胞MGC-803的溶酶体膜的完整性都遭到破坏，而通过免疫荧光观察Cathepsin B的亚细胞定位发现其由溶酶体内释放到了胞质内，则香加皮杠柳苷诱导细胞凋亡可能有溶酶体途径的参与，且可能依赖Caspase信号通路。但是溶酶体酶膜通透性增加并释放Cathepsin B，导致细胞凋亡的具体机制仍不清楚。进一步深入的研究探讨，溶酶体膜通透性增加诱导细胞凋亡的具体机制，为香加皮杠柳苷用于肿瘤的治疗提供理论依据，这也是本课题组下一步研究工作的重点。

综上所述，香加皮杠柳苷可通过溶酶体凋亡途径诱导胃癌MGC-803细胞凋亡，但其具体作用机制尚有待深入研究。