0 引言

最新统计资料显示肺癌在我国城市恶性肿瘤的发病中已高居首位，且其发病率仍呈明显上升趋势，每年增长率高达26.9%，预计到2025年中国将成为世界第一肺癌大国^[1]。小细胞肺癌的发病率约占全部肺癌患者的20%，发病人数也将达到相当数量。目前对小细胞肺癌的临床治疗主要以化疗为主，尽管患者对化疗药物反应较敏感，但由于极易出现抗药性，化疗效果常不理想，临床预后差。阐明小细胞肺癌化疗抗药性的分子机制，已成为当今肺癌临床治疗学的重要研究课题之一。

1 材料和方法 1.1 材料

人小细胞肺癌敏感细胞株（H69）和其阿霉素耐药株（H69AR）均购自美国ATCC公司,新生胎牛血清、RPMI 1640培养液购自美国Gibco公司；顺铂、阿霉素和依托泊苷购自辉瑞公司；CCK8、细胞周期及凋亡检测试剂盒购自上海碧云天公司，microRNA检测试剂盒、聚合酶链反应（PCR）试剂盒、miR-143/145模似体（mimic）和抑制物（antagomir）购自上海吉玛公司；LipofectamineTM 2000和Opti-MEM I购自美国Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-143/145 mimic和antagomir转染H69AR细胞

H69AR细胞消化、离心，转至6孔板中培养，待细胞生长到60%融合时，在50 µl的Opti-MEM无血清培养液中加入100 pmol miRNA mimic或antagomir柔和混匀；轻柔混匀Lipofectamine 2000试剂，用50 µl Opti-MEM I稀释1 µl Lipofectamine 2000试剂，轻轻混匀，室温放置5 min；将稀释好的miRNA mimic或antagomir和Lipofectamine 2000试剂混合；轻柔混匀，室温放置20 min，以便形成miRNA/Lipofectamine 2000复合物；再加入400 µl细胞悬浮液（浓度为2×10⁵个每毫升），细胞在CO₂培养箱中37℃温育，4~6 h后，除去复合物，更换培养液；24~48 h后，提取细胞RNA和总蛋白备用。

1.2.2 实时荧光定量PCR检测miRNA表达水平

取上述准备的RNA，反转录反应参照AMV反转录试剂盒说明，在20 μl体系中加2 μg总RNA进行cDNA的合成。实时荧光定量PCR采用2×SYBR Green PCR Master Mix，取适量cDNA作为摸板，引物浓度0.4 μmol/L，15 μl体系进行扩增，每个待测样本设置3个平行样。合成用于特异扩增miRNA引物，直接使用目标miRNA的成熟序列，参照Sanger miRBase数据库。以U6 snRNA作为内参，PCR反应在实时定量PCR反应仪上进行。三次独立实验后得到的数据运用公式RQ=2^-∆∆Ct的方法进行分析。

1.2.3 miR-143/145 mimic和antagomir对细胞增殖和周期的影响

（1）流式细胞仪分析细胞周期变化。取生长状态良好细胞，接种于6孔板，无血清培养16 h，用Lipofectamine 2000和Opti-MEM I （Invitrogen）分别将miR-143/145 mimic和antagomir及阴性对照（100 pmol）转入细胞。转染24 h后，用0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA消化细胞，PBS洗2次，用75%乙醇冰浴固定24 h，然后用含1%BSA的PBS充分混匀洗涤2次，PI染色后进行流式细胞仪测定并用Cell Quest软件分析各组细胞群体在细胞周期各个时相的分布比例。（2）流式细胞仪分析细胞凋亡变化。Annexin Ⅴ/PI染色法。对数生长期的H69AR细胞以4×10⁵个每孔接种于6孔板中；用Lipofectamine 2000和Opti-MEM I （Invitrogen）分别将miR-143/145 mimic和antagomir及阴性对照（100 pmol）转染入H69AR细胞，37℃培养48 h；收集细胞，PBS洗涤2次；细胞重悬于100 μl含Annexin Ⅴ-FITC和0.5 μg PI的结合缓冲液（10 mM HEPES、pH7.4、0.15M NaCl、5 mM KCl、1 mM MgCl2、1.8 mM CaCl₂）中；避光室温孵育15 min； 加入400 μl结合缓冲液；流式细胞仪分析，按下列公式计算细胞的凋亡指数：细胞凋亡指数＝（早期凋亡细胞数＋晚期凋亡细胞数）/总细胞数×100%。

1.2.4 CCK8法检测细胞对化疗药物的敏感度

收集对数生长期细胞，用0.25%胰酶消化后重悬，计数后按5×10³ 个每孔接种于96孔培养板中，每孔总体积100 µl。置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养24 h后，转染miR-143/145 mimic和antagomir及阴性对照（100 pmol）入细胞，每孔总体积为100 µl。置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养24 h后，分别将阿霉素（ADM）、顺铂（DDP）和依托泊苷（VP-16）化疗药物加入培养液中，并进行倍比稀释，按不同浓度ADM（12.5、25、50、75、100 µg/ml）、DDP（50、100、200、300和400 µg/ml）和VP-16（100、200、400、600和800 µg/ml）分别加入指定的孔中，并设不加药物的为阳性对照孔，设5个复孔。置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养24 h，加入CCK8反应液，在37℃、5%CO₂环境下培养4 h，应用酶标仪测得450 nm吸光度（A）值。计算存活率，存活率＝（不同药物浓度的A值平均值-空白孔A值平均值）/不含药物的阳性对照组A值平均值。根据不同药物浓度的细胞存活率，绘制对数曲线，计算细胞生存率50%时的药物浓度（IC₅₀）。参照3种化疗药物的血浆高峰浓度在各种转染细胞中分别加入0.01、0.1、1和10倍血浆高峰浓度的化疗药物，每种药物的每一浓度设4个重复孔；阴性对照组：仅加细胞不加药物，设4个重复孔；空白调零组：仅加细胞培养液，设4个重复孔。以3×10³个每孔细胞接种于96孔培养板中，每孔加入200 μl培养液；细胞贴壁后，将3种化疗药物按不同浓度加入各孔细胞，继续常规培养72 h；每孔加新鲜配制的CCK8溶液（5 μg/μl）20 μl，37℃、5%CO₂下继续培养0.5~4 h后，终止培养。选择450 nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，取每4个重复孔的光吸收值（A值）的平均值，计算各种转染细胞在3种化疗药物不同浓度下的存活率；细胞存活率=（实验组A值－空白对照组A值）/（阴性对照组A值－空白对照组A值）×100%。重复实验三次，取平均值，以细胞存活率为纵轴，药物浓度对数为横轴作半对数图，并按作图法求出3种药物的IC₅₀值。

1.3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件分析，计量资料采用t检验或One-way ANOVA检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 miR-143/145基因簇在敏感株（H69）和耐药株（H69AR）中的表达

qRT-PCR结果显示H69AR细胞株中miR-143和miR-145的miRNA表达较H69细胞明显升高，差异有统计学意义（P=0.000），见图 1。

2.2 miR-143/145 mimic和antagomir对细胞miR-143和miR-145表达的影响

通过转染miR-143/145 mimic和antagomir分别上调H69细胞和下调H69AR细胞株中miR-143和miR-145的表达，见图 2，与对照组H69细胞比较，转染miR-143/145 mimic后miR-143和miR-145的表达分别增加了3.9和4.6倍，见图 2A，而H69AR细胞转染miR-143/145 antagomir后miR-143和miR-145的表达分别较对照组H69AR降低了59%和61%，差异有统计学意义（P=0.000），见图 2B。

2.3 miR-143/145基因簇对细胞周期的影响

流式细胞技术检测示：与对照组相比，H69细胞转染miR-143/145 mimic后，细胞周期出现G₂/M期明显增加，差异有统计学意义（P=0.002）。而H69AR细胞转染miR-143/145 antagomir后细胞周期出现G₀/G₁期阻滞，与H69AR比较差异有统计学意义（P=0.001），见表 1。

2.4 miR-143/145 mimic和antagomir对细胞凋亡的影响

流式细胞仪分析细胞凋亡变化：H69组细胞的凋亡率为（18.9±1.43）%，H69细胞转染miR-143/145 mimic后凋亡率分别为（9.3±1.09）%和（8.6±0.94）% （P=0.006），H69AR组凋亡率为（5.62±0.43）%，H69AR细胞转染miR-143/145 antagomir后凋亡率分别为（19.92±2.43）%和（16.98±1.943）%（P=0.008），miR-143/145 mimics能抑制细胞的凋亡，miR-143/145 antagomir则促进细胞凋亡，见图 3。H69细胞转染miR-143/145 mimic后，抗凋亡蛋白BCL2无论是mRNA水平（图 4A）还是蛋白水平（图 4B）均明显增加，差异有统计学意义（P=0.001），而H69AR细胞转染miR-143/145 antagomir后抗凋亡蛋白BCL2无论是mRNA水平（图 4C）还是蛋白水平（图 4D）均明显降低，差异有统计学意义（P=0.007），进一步证实了miR-143/145的表达与小细胞肺癌的增殖和凋亡密切相关。

2.5 miR-143/145 mimic和antagomir对化疗药物敏感度的影响

CCK8检测示H69细胞转染miR-143/145 mimic后对顺铂（DDP），阿霉素（ADM）及依托泊苷（VP-16）的敏感度较H69明显降低（P=0.000），见图 5A，而转染了miR-143/145 antagomir的H69AR细胞对DDP、ADM及VP-16的敏感度较H69AR明显增加（P=0.000），见图 5B。

3 讨论

miRNAs是近年来在真核生物中发现的一类由19~25个核苷酸组成的非编码RNA，越来越多的研究结果显示miRNAs代表了一个新层次的基因表达调控方式，目前人类基因组中已经鉴定的miRNA有1 048个^[2]。研究发现大约50%得到注解的miRNA在基因组上定位于与肿瘤发生相关的区域和脆性位点^[3]，单个miRNA可调控200多个靶基因，约1/3的蛋白编码基因受miRNA调控。miRNA能够控制特定基因是否进行表达，参与基因转录后水平的调控，可能作为某些基因表达的重要调节分子，参与细胞增殖、分化、凋亡、周期调控和信号转导等生物学过程，在生物发育和肿瘤发生中发挥着重要的调控作用^[4-5]。已报道miRNA在各种肿瘤中表达失常，可能发挥着癌基因和抑癌基因的双重作用。同时越来越多的研究表明miRNA在调节肿瘤细胞对抗肿瘤药物耐药方面发挥着重要作用。miR-143/145基因簇同位于染色体5q32位点上，是目前发现的一对具有重要生物学功能的miRNAs基因簇^[6]。许多研究发现miR-143和（或）miR-145在多种肿瘤中发挥着肿瘤抑制的功能^[7-13]。目前还有一些研究发现miR-143/145簇的下调与直肠癌的发生有关，并且在疾病的早期就出现了表达下调，而经化学修饰的miR-143可能作为一种潜在的RNA药物用于直肠肿瘤的治疗^[14]；在对前列腺癌的研究中发现miR-143通过靶向作用于EGFR/RAS/MAPK信号通路，能够抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移，同时增加对多西紫杉醇的敏感度^[15]。

我们通过基因芯片检测小细胞肺癌耐药细胞株（H69AR）和敏感细胞株（H69）中microRNA的表达发现，miR-143/145簇的表达在H69AR细胞株中较H69明显增高。为了进一步验证芯片结果，我们通过qRT-PCR检测了H69AR和H69细胞株中miR-143/145簇的差异表达，与芯片的结果一致。同时利用miR-143/145模拟体（mimics）或抑制物（antagomir）增加或阻断细胞内miR-143/145的水平，发现miR-143/145簇mimic能够引起细胞周期的G2/M期阻滞，抑制细胞的凋亡从而引起细胞对化疗药物的耐药；而本结果与Liu等^[16]研究发现miR-145通过靶向作用于DNA损伤相关基因RAD18的表达逆转结直肠癌药物抵抗的研究相反，这可能与microRNA表达的时序性和组织特异性相关。然而影响小细胞肺癌耐药的因素很多，关于miR-143/145在小细胞耐药中的具体作用机制尚需进一步研究。