人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）属于小双链DNA病毒，主要感染皮肤和黏膜上皮细胞，导致上皮增生甚至恶性转化^{[1, 2, 3, 4]}。目前共发现约150多种型别HPV病毒，其中40多种能够感染生殖道^[1]。针对HPV L1保守区序列设计的通用引物进行PCR扩增，是目前最常用的大样本检测方法。Huang等结合两种经典通用引物GP5+/GP6+^[5]和SPF1/SPF2^[6]，建立了SPF1/GP6+^[7]方法，该方法因具有较高的检测敏感度已得到广泛的应用^{[8, 9, 10]}，但由于GP6+引物序列单一而且鸟嘌呤（Guanine, G）和胞嘧啶（Cytosine, C）含量过低（20%），在检测敏感度和特异性方面依然有缺陷^[11]。本研究重新设计并调整了GP6+引物序列，改用4条GP6++简并引物，在提高引物GC含量的同时兼顾了引物与多型别HPV序列的匹配，并以自行构建的包含15种型别HPV L1模拟靶基因序列的重组质粒为模板，对比SPF1/GP6+与SPF1/GP6++两组通用引物的检测敏感度，并进一步在68例人宫颈癌组织DNA样本中进行对比验证。

TransTaq DNA Polymerase High Fidelity（HiFi），pEASY-T1克隆载体和Trans10感受态细胞购自北京全式金生物技术公司。引物由北京奥科生物技术公司合成。质粒测序由华大基因公司完成。健康者血细胞基因组DNA提取应用外周血基因组DNA提取试剂盒（Universal Genomic DNA Extraction Kit, 日本TaKaRa公司）。包含HPV16全长DNA序列的质粒由德国肿瘤研究中心Zur Hausen博士惠赠。选取2005年9月—2006年2月汕头大学医学院附属肿瘤医院宫颈癌手术和活检石蜡包埋组织68例，组织DNA提取应用固定组织基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司）。

SPF1通用引物序列参考文献^[6]，由4条简并引物（SPF1A，1B，1C，1D）组成，见表 1。引物间有3处碱基存在差异，在另外2处差异较大的序列位点引入肌苷来替代常规碱基。GP6+和GP6++引物序列见图 1。GP6++由4条简并引物组成，在GP6+引物的3′端增加了TTC或CTC序列，提高了引物的GC含量。GP6++的4条引物序列之间有4处碱基存在差异，增加了引物与多型别HPV靶基因序列的结合能力。图 1显示了GP6+和GP6++引物与宫颈癌和头颈部等肿瘤的15种常见感染型别HPV模板序列的碱基配对情况。

表 1 SPF1引物序列 Table 1 Sequences for SPF1 primer set

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Dots represented identical bases and italic represented mismatched base pairs; *: GP6++ comprised of 4 consensus primers 图 1 GP6+与GP6++引物序列以及引物与15种型别HPV L1 读码区序列的碱基配对情况 Figure 1Alignment of GP6+ and GP6++ sequences with the corresponding regions in L1 open reading frame of 15 HPV genotypes

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1.2.2 多种型别HPV L1区模拟靶基因序列的扩增和重组质粒的构建

为比较SPF1/GP6+和SPF1/GP6++通用引物对多种型别HPV的检测敏感度，我们以包含HPV16全长DNA序列的质粒为模板，以对应于SPF1/GP6+和SPF1/GP6++通用引物结合区的型别特异性引物进行PCR扩增，见表 2，获得了HPV11, 16, 18, 31, 33, 34, 35, 39, 51, 52, 53, 56, 58, 61和66共15种模拟靶基因序列。这些序列中与SPF1/GP6+和SPF1/GP6++通用引物结合的区域为上述各型HPV的特异序列，而位于通用引物结合区之间的序列均为HPV16型相应的序列。

表 2 15种型别HPV的L1读码区序列特异性引物 Table 2 Specific primers for L1 open reading frame of 15 HPV genotypes

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PCR反应条件：94℃预变性2 min后，94℃ 30 s，56℃ 40 s，72℃ 40 s，循环34次，72℃延伸10 min。将3 μl PCR产物与1 μl pEASY-T1克隆载体混合，室温放置10 min，连接产物转化Trans10感受态细胞，蓝白斑筛选，挑克隆培养，小提质粒并测序验证。

将包含15种型别HPV L1模拟靶基因序列的重组质粒进行梯度稀释，分别将100，101，102，103，104，105拷贝的重组质粒与50 ng无HPV感染的人血细胞基因组DNA混合作为PCR模板，模拟15种型别HPV病毒感染的待测样本。使用SPF1/GP6+与SPF1/GP6++引物进行PCR扩增，50 μl反应体系，反应条件：94℃预变性2 min后，94℃ 30 s，50℃ 40 s，72℃ 38 s循环36次，72℃ 10 min延伸。5 μl扩增产物行2%琼脂糖凝胶电泳并成像。

应用固定组织基因组DNA提取试剂盒并按照操作说明提取宫颈癌石蜡包埋组织DNA，应用GAPDH引物行PCR扩增以检测组织DNA的质量^[8]。针对GAPDH扩增阳性样本，取50 ng DNA做模板，进一步应用SPF1/GP6+和SPF1/GP6++通用引物开展HPV型别的检测（PCR扩增条件同前述，均设立严格的阴性和阳性对照）。将获得扩增产物克隆入pEASY-T1载体并转化感受态细菌后铺盘，针对每例组织样本分别挑取15个克隆进行测序，测序结果与GenBank数据库比对，分析组织HPV感染型别。

以包含HPV16全长DNA序列的质粒为模板，以15种HPV L1基因型别特异性引物进行PCR扩增，获得各自的模拟靶基因序列，进一步克隆入pEASY-T1载体获得重组质粒。使用T7引物测定插入序列，测序结果与GenBank数据库比对，结果显示模拟靶基因序列中与SPF1/GP6+和SPF1/GP6++通用引物结合的区域为上述各型别HPV的特异序列，测序图略。

SPF1/GP6+与SPF1/GP6++两组通用引物对不同拷贝数HPV重组质粒的扩增结果见图 2和表 3，扩增产物长度均为184 bp。与SPF1/GP6+ PCR比较，SPF1/GP6++ PCR对HPV31，34，61，66的检测敏感度提高了2个数量级；对HPV11，39，52，56，58的检测敏感度提高了1个数量级；应用SPF1/GP6+引物检测不到105拷贝的HPV51 和53重组质粒，而应用SPF1/GP6++引物，103拷贝的HPV 51和104拷贝的HPV53重组质粒均有明显的扩增产物；对于HPV16，18，33和35四种常见高危型别，两组通用引物的检测敏感度相似。

0, 1, 2, 3, 4, 5: 50 ng human genome DNA mixed with 100, 101, 102, 103, 104, 105 copy of HPV recombinant plasmids, respectively; M: DNA marker 图 2 应用SPF1/GP6+与SPF1/GP6++通用引物对15种型别HPV的PCR扩增结果 Figure 2Amplification results of 15 HPV genotypes using SPF1/GP6+ and SPF1/GP6++ general primers

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表 3 SPF1/GP6+与SPF1/GP6++PCR对15种型别HPV的检测敏感度 Table 3 Examination sensitivity of SPF1/GP6+ and SPF1/GP6++ PCR for 15 HPV genotypes

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应用GAPDH引物对宫颈癌组织DNA行PCR扩增，68例样本均有扩增产物（结果略）。进一步应用SPF1/GP6+和SPF1/GP6++通用引物对组织DNA进行扩增，产物构建入pEASY-T1克隆载体并行测序和数据库序列比对分析，见表 4。应用SPF1/GP6++检测样本HPV感染的总阳性率为98.5%（67/68），检测到11例双重感染和2例三重感染（分别为HPV 16/18/58和HPV 16/58/39）；而应用SPF1/GP6+引物检测的总阳性率为95.6%（65/68），仅检测到7例双重感染。

表 4 SPF1/GP6+和SPF1/GP6++通用引物检测人宫颈癌组织中HPV型别的分布 Table 4 HPV genotype distribution in human cervical cancer tissues detected by universal primer SPF1/GP6+ orSPF1/GP6++

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据文献报道，在世界范围内HPV病毒感染与15%的人类肿瘤发病相关^{[1, 2, 3, 4]}，中国生殖器疣患者HPV总感染率为84.2%，宫颈癌患者HPV总感染率超过80%^[12]。因此，建立和改进HPV病毒检测的有效方法具有重要的基础研究与临床应用价值。HPV型别众多，而通用引物可以在一次PCR反应中同时检测多种型别的HPV感染，与序列特异PCR相比，可以大大减少工作量和检测成本，并可发现新的病毒类型、亚型及变异体。因此，通用引物PCR是目前最常用的高通量HPV病毒检测方法。但是，通用引物仅能与少数型别HPV引物结合区完全匹配，而与多数型别HPV序列存在或多或少的碱基错配，使得通用引物对不同型别HPV的扩增效率不同，从而影响了对多型别HPV病毒检测的灵敏性^[13]。因此，对通用引物检测的灵敏度和特异性的改进一直是研究的热点。

目前针对HPV L1基因保守区设计的通用引物主要包括GP5+/GP6+^[5]，SPF1/SPF2^[6]，SPF1/GP6+^[7]等。GP5+/GP6+扩增片段长度适中（约140 bp），可通过PCR产物直接测序进一步判断HPV的型别，是目前最常用的通用引物。但该引物组合只有两条序列，GC含量均偏低（GP5+为35%，GP6+为20%），而且与多型别HPV序列错配严重，降低了检测的敏感度和特异性。SPF1通用引物由4条简并引物混合而成，通过不同碱基的组合以及在不同型别HPV序列差异较大的位点处引入肌苷来替代常规碱基，明显增强了引物与多型别HPV序列的匹配能力，可以采用较严格的PCR条件，其检测敏感性和特异性也得到明显提高。但是SPF1/SPF2扩增片段偏短（约60 bp），其产物只能通过探针杂交检测，方法复杂，而且产物提供的病毒序列信息也十分有限。SPF1/GP6+方法结合了SPF1简并引物与多型别HPV序列良好匹配的特点，扩增片段长度约180 bp，也可通过产物直接测序来判断HPV的型别。但是GP6+引物仍存在序列单一和GC含量过低的问题，在检测灵敏度和特异性方面仍然有较大改进空间。

在SPF1/GP6+通用引物基础上，本研究进一步调整了GP6+引物序列，改用4条GP6++简并引物。这些引物在GP6+引物的3′ 端增加了TTC或CTC序列，提高了引物的总体GC含量（24%），增强了引物与模板的结合能力。GP6++的4条引物序列之间有4处位点引入差异碱基，充分考虑了宫颈癌和头颈部等肿瘤常见的高危型HPV在这些位点的碱基序列，从而进一步增加了简并引物与多型别HPV靶基因序列的结合能力。为比较SPF1/GP6+和SPF1/GP6++通用引物对多种型别HPV的检测灵敏度，我们以包含HPV16全长DNA序列的质粒为模板，以型别特异性引物进行PCR扩增，获得了宫颈癌和头颈部等肿瘤常见的15种型别HPV L1区的模拟靶基因序列。这些序列中的引物结合区模拟了型别特异HPV序列与SPF1/GP6+和SPF1/GP6++通用引物的碱基配对的真实情况。将模拟靶基因序列构建入pEASY-T1载体并获得重组质粒。将梯度稀释的HPV L1重组质粒掺入50 ng无HPV病毒感染的健康者基因组DNA，模拟各种型别HPV病毒感染的待测样本，对比SPF1/GP6+与SPF1/GP6++通用引物的检测敏感度。检测结果显示，与SPF1/GP6+相比，SPF1/GP6++对HPV 11，31，34，39，51，52，53，56，58，61 ，66等11种型别HPV的扩增敏感度提高了1到2个数量级。进一步在68例宫颈癌组织DNA样本中的检测结果显示，应用SPF1/GP6++通用引物检测样本HPV感染的总阳性率（98.5%）高于SPF1/GP6+引物（95.6%），尤其是检测到的HPV多重感染（包括双重感染和三重感染）的样本例数（13例）明显多于应用SPF1/GP6+ PCR检测到的阳性样本例数（7例）。

在本研究中，兼顾通用引物与多型别HPV序列的匹配，通过增加通用引物的数量和提高引物GC含量，在SPF1/GP6+ PCR基础上建立了SPF1/GP6++ PCR方法，并应用质粒DNA模板和组织DNA模板证实了SPF1/GP6++ PCR具有更高的检测灵敏度和更广的HPV型别检测范围，为基础研究和临床工作中准确鉴定组织样本的HPV感染型别提供了更为敏感有效的检测手段。