0 引言

Globcan 2012年数据显示^[1]泌尿生殖系统肿瘤占所有癌症新发病例的31%，对人类健康和生命形成严重威胁。目前泌尿系统肿瘤手术治疗会严重影响患者的生活质量，临床使用的放化疗药物缺乏选择性和靶向性，会对癌症患者产生严重的不良反应。因此寻找高效低毒、具有靶向性和选择性抗癌作用的化疗药物是抗肿瘤药物研究的一个重要方向和迫切任务^[2-3]。

我们前期研究^[4-10]表明，松萝提取物（extractive of usnea diffracta vain, AMH）对生产生活中常见的强致癌物、致突变物具有很强的抗突变作用，AMH对人类多种癌细胞具有很强的体外抗癌作用，并且对人体正常细胞几乎无细胞毒作用，可能在抗肿瘤药物研发方面具有良好的应用前景。

AMH-T（total of extractive usnea diffracta vain）是我们从松萝提取物AMH中分离的总抗癌活性部位。本研究观察了其对常见的人类泌尿系统肿瘤的体内和体外抗肿瘤作用，以及与临床抗癌药物的联合抗癌作用，并观察了AMH-T对动物的一般毒性，探讨其致癌细胞凋亡的可能作用机制，为后期的深入研究和抗癌药物研发提供科研资料。

1 材料与方法 1.1 材料

1.1.1 试剂

DMEM/F12培养液、南美进口胎牛血清、磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶均由HyClone（北京）公司生产。DMSO（二甲基亚砜）为分析纯，西陇化工股份（广东）有限公司生产。Caspase-8荧光检测试剂盒由凯基生物（南京）有限公司生产。DDP（顺铂）由齐鲁制药（山东）有限公司生产。

1.1.2 样品AMH-T的提取

采用硅胶柱层析对AMH进行分离和体外抗癌活性追踪，得到总抗癌活性部位AMH-T。AMH-T以分析纯DMSO进行配制，体外实验浓度分别为2 µg/ml（T1）、4 µg/ml（T2）、8（T3）、16 µg/ml（T4）、32 µg/ml（T5），体内抗癌试验剂量为50 mg/kg。

1.1.3 细胞株

选择人泌尿生殖系统肿瘤中具有代表性以及科研上常用的肾癌细胞株ACHN、移行性膀胱癌细胞株T-24、前列腺癌细胞株PC-3和宫颈癌细胞株HeLa进行研究，癌细胞株均由中国科学院昆明动物研究所细胞库提供。

1.1.4 实验动物

选择10只雄性Balb/c裸鼠进行研究。裸鼠购于北京维通利华实验动物技术有限公司，35~50日龄，体质量18~20 g，许可证号：SCXK（京）2012-0001；小鼠饲养于SPF级实验室中。

1.2 实验方法

1.2.1 体外抗肿瘤实验

实验分组：设DMSO对照组、阳性对照组（2 µmol/L DDP）和5个剂量的AMH-T组（2、4、8、16、32 µg/ml）。

实验方法：收集对数期细胞，调整细胞浓度，接种于96孔板，贴壁培养24 h，移去培养液，每孔加入含待测物的培养液200 µl，继续分别培养24、48、72 h后移去培养液，每孔加入含10%MTT（5 mg/ml）的完全培养液200 µl，培养箱中继续培养4 h，弃上清液，每孔加入150 µl DMSO，避光振荡10 min，采用酶标仪在490 nm波长处测定每孔吸光度值（OD）。计算IC₅₀值和抑制率，绘制剂量-效应和时间-效应曲线图。

1.2.2 体外联合抗癌作用

设溶剂对照组（DMSO）、阳性对照组（DDP）、AMH-T组（T1、T2、T3）和联合用药组（DDP+T1、DDP+T2、DDP+T3）。用金氏公式计算q值。

（1）OD_校正值= OD_实验组-OD_空白组

（2）抑制率（%）=（校正OD值_DMSO组-校正OD值_药物组）/校正OD值_DMSO组×100%；

（3）金氏公式^[11]：q=E_（A+B）/（E_A+E_B-E_A×E_B）。其中E_（A+B）为两药联合用药时的抑制率，E_A、E_B分别为两药单独用药时的抑制率。如q值小于0.55则两药为显著拮抗作用；q值在0.55~0.85之间，则两药为拮抗作用；q值在0.85~1.15之间，则两药为相加作用；q值在1.15~2.0之间，则两药为协同作用；q值大于2.0，则两药为显著协同作用。

1.2.3 体内抗肿瘤作用研究

HeLa移植瘤模型的建立：收集对数期HeLa细胞，以PBS清洗2次，以无血清培养液调整细胞浓度为1×10⁸个/毫升，吹打混匀，无菌操作接种于Balb/c裸鼠的右前侧背部皮下，每鼠接种0.1 ml。

分组和给药：在肿瘤体积大约为100 mm³时，将10只符合实验条件的荷瘤小鼠按照肿瘤体积大小分成DMSO对照组和AMH-T组，每组5只荷瘤小鼠。分组当天开始腹腔注射给药，隔天给药一次，每次每只给药0.05 ml，共给药12次。每四天测量一次肿瘤体积和裸鼠体重。停药后第三日将裸鼠脱臼处死，测定肿瘤体积和小鼠体重后，完整剥离肿瘤、肝脏、脾脏、肾脏、睾丸和心脏并称重，计算肿瘤重量抑瘤率、肿瘤相对体积、肿瘤相对增殖率和脏器系数（organ coefficient）。

（1）肿瘤体积（TV）=a×b²/2，a为长径，b为短径；

（2）相对肿瘤体积（RTV）=V_T/V₀，V₀是分组时的肿瘤体积，V_T是实验中每次测量的肿瘤体积；

（3）肿瘤相对增殖率（RPR）=（T_RTV/C_RTV）×100%，T_RTV是实验组的相对肿瘤体积，C_RTV是对照组的相对肿瘤体积；

（4）肿瘤重量抑制率（IR）=（对照组肿瘤重量-实验组肿瘤重量）/对照组肿瘤重量×100%；

（5）脏器系数=（脏器重量/动物体重）×100%。

1.2.4 Caspase-8活性测定

样品处理：设DMSO组和2、4、8 µg/ml的AMH-T组。将DMSO和AMH-T处理24 h后的HeLa细胞收集到编好号的离心管中，离心、弃上清液、用PBS洗涤细胞两次，除去PBS上清液。收集约（3~5）×10⁶个细胞，加入100 µl冰冷裂解液（使用前每50 µl裂解液中加入0.5 µl DTT），吹打均匀。冰上裂解30 min，期间涡旋振荡3~4次，每次10 s；裂解后，4℃、10 000 r/min离心1 min，转移至新的EP管中，冰上待用；取少量裂解液，以BCA法测定蛋白浓度。Caspase-8检测：取30 µl含200 µg蛋白的HeLa细胞裂解液，加50 µl的2×缓冲液、10 µl ddH₂O、10 µl Caspase-8基底液，37℃避光孵育1 h，用酶标仪测定荧光强度。

Caspase-8活性（%）=（OD_实验组-OD_对照组）/ OD_对照组×100%。

1.3 统计学方法

所有数据以（x± s）表示，采用SPSS17.0软件进行分析，以t检验进行差异性分析，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 AMH-T的体外抗癌作用

体外抗癌实验结果表明，AMH-T对ACHN、T-24、PC-3和HeLa细胞均具有很好的体外抗癌作用，随着药物剂量的增加及作用时间的延长，抑制率增加，AMH-T对泌尿生殖系统肿瘤细胞的体外抗癌作用具有明显的剂量-反应和时间-效应关系，见图 1。AMH-T对ACHN、T-24、PC-3和HeLa的IC₅₀（72 h）值分别为19.64、5.73、15.54和11.46 µg/ml。不同癌细胞对AMH-T的敏感度有较大差异，其中膀胱癌T-24对AMH-T最敏感，AMH-T体外具有细胞靶向性抗癌作用。

研究中发现，显微镜下观察结果与MTT检测结果存在明显差异。AMH-T在浓度为8 µg/ml时，72 h后，显微镜下见癌细胞绝大部分死亡，但MTT测定的四种细胞的最高抑制率只有61.02%、65.78%、86.57%、74.41%，两者差异明显。镜下T-24细胞的72 h结果见图 2。

2.2 AMH-T与DDP的体外联合抗肿瘤作用

DDP与AMH-T对人泌尿生殖系统肿瘤联合用药的q值见表 1，结果显示AMH-T与DDP对人泌尿生殖系统肿瘤具有体外协同或相加抗肿瘤作用。其中AMH-T在4 μg/ml时与DDP联合用药对肾癌ACHN呈现显著性协同抗癌作用。

2.3 体内抗肿瘤作用

急性毒性试验中，AMH-T经腹腔注射对雄性小鼠的半数致死量LD₅₀为147 mg/kg。根据前期Balb/c裸鼠体内抗宣威肺癌实验中的发现，50 mg/kg AMH-T对裸鼠无明显的毒性作用且对宣威肺癌具有明显的体内抗癌作用（待发表），因此本研究选择AMH-T的1/3 LD₅₀剂量即50 mg/kg作为本次体内抗癌实验剂量。

2.3.1 对移植瘤生长的抑制作用

不同时间点HeLa的相对肿瘤体积结果见图 3。AMH-T组在各时间点的相对肿瘤体积明显低于对照组，随着给药次数的增加，相对肿瘤体积上升趋势明显比对照组缓慢，肿瘤几乎无生长。

在第4、8、12、16、20、24天，AMH-T组的HeLa肿瘤体积相对增殖率（relative proliferation ratio, RPR）分别为45.96%、36.26%、28.12%、23.67%、26.55%和27.84%，见图 4。根据抗癌药物体内实验活性判断标准，给药后，AMH-T组的肿瘤体积相对增殖率均低于60%，本次实验的最低肿瘤相对增殖率只有23.67%，表明AMH-T具有很强的体内抗肿瘤作用。AMH-T对HeLa细胞抑制作用呈时间-效应关系，肿瘤相对增殖率随着给药次数的增加呈现下降趋势。

实验结束时，对照组的平均瘤重为0.6148 g，AMH-T试验组的平均瘤重为0.2816 g，AMH-T对HeLa移植瘤的肿瘤重量抑瘤率为54.20%，结果也表明AMH-T具有明显的体内抗肿瘤作用，见图 5。

从解剖图可见，溶剂对照组肿瘤表面不光滑、布满新生血管，而AMH-T给药组小鼠肿瘤明显缩小，肿瘤表面光滑、肿瘤表面苍白。

2.3.2 对小鼠的一般毒性观察

整个实验过程中两组动物的体重均未见增长，并有一定的下降，特别是初次给药后，对照组和AMH-T组小鼠体重都有较大下降，这可能与溶剂DMSO对腹腔的刺激有关。AMH-T组小鼠后期体重均在小幅度范围内波动，未呈现持续性明显下降和消瘦状态，说明AMH-T在使用剂量下对动物急性毒性不大。各时间点的体重结果见图 6。

AMH-T组裸鼠肝脏的脏器系数显著低于对照组（P < 0.05），脾脏、肾脏、心脏和睾丸的脏器系数与对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05），说明AMH-T对小鼠肝脏发育有一定影响，但对其他脏器发育没有明显毒性。脏器系数结果见表 2。

2.4 Caspase-8活性检测结果

研究结果表明，HeLa细胞经AMH-T处理24 h，各剂量组Caspase-8的活性与对照组相比差异无统计学意义（P=16.25），说明AMH-T诱导细胞凋亡不是通过Caspase-8信号通路。Caspase-8活性检测结果见图 7。

3 讨论

化学治疗是治疗泌尿生殖系统肿瘤的一个重要手段，但一些泌尿生殖系统肿瘤对化疗药物敏感度差，导致其复发率高，患者的生存质量差^[12]。因此筛选敏感的化疗药物对泌尿生殖系统肿瘤的治疗具有重要价值。本研究结果表明，松萝提取物活性部位AMH-T对受试的泌尿生殖系统癌细胞株具有显著的体内和体外抗癌作用，可能在肿瘤药物治疗方面具有良好的应用前景。

顺铂是泌尿生殖系统肿瘤常用的化疗药物，它具有抗癌谱广、疗效确切等特点，临床上常用于多种肿瘤的治疗。但其通过DNA交联阻滞癌细胞增殖复制而发挥抗癌作用，缺乏选择性，不良反应大，且容易产生耐药，因此临床上常采用联合用药来提高化疗药物的疗效，降低其不良反应，减少耐药现象，提高患者的耐受性^[13-14]。本研究发现，AMH-T联合DDP作用于ACHN、PC-3和T-24细胞显示出明显的协同抗癌作用，因此AMH-T可以作为DDP在治疗泌尿生殖系统肿瘤时的增敏药物来提高DDP的疗效、减少DDP的用量。

本实验中显微镜下的观察结果与MTT比色法的测定结果存在明显差异，MTT测定结果明显低于显微镜下观察结果，考虑与样品的性质有关。AMH-T是地衣的粗提取物，具有较深颜色，会导致MTT测定时的吸光度值偏高，且随着浓度的增高而影响增加，从而导致MTT测定的抑制率比实际值偏低，并且浓度越高，实际抑制率偏差越大。AMH-T对这4个受试泌尿生殖系统癌细胞株的体外实际抑制率应远高于本次MTT测定的抑制率。

前期研究发现，AMH-T能显著促进癌细胞凋亡及细胞凋亡标志物cleaved PARP的形成，其促凋亡作用与Caspase-3活化无关^[15]。本研究证明，AMH-T促进细胞凋亡也不是通过Caspase-8信号通路，因此，AMH-T促进癌细胞凋亡可能存在其他作用机制，值得我们在后期研究中进行探讨。AMH-T能明显影响癌细胞的分裂周期，将细胞阻滞于G₀/G₁期，减少S期细胞。AMH中的一些功效化合物能显著影响人类癌细胞中很多基因的表达，其中包括显著影响人类前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、甲状腺癌、膀胱癌、卵巢癌、急性髓性白血病、慢性粒细胞性白血病等癌症的通路基因表达（待发表）。AMH-T的抗癌作用与影响癌细胞的周期时相分布、影响癌细胞的基因表达及一些信号通路有关，具体作用机制也有待进一步研究。本次的动物体内抗HeLa移植瘤实验中观察到，AMH-T给药组小鼠的肿瘤表面光滑、呈现苍白色，而溶剂对照组小鼠肿瘤上血管丰富、肿瘤表面凹凸不平，提示AMH-T对小鼠肿瘤生长的抑制作用可能与抑制肿瘤的血管形成有关。

总之，本研究证明，松萝提取物AMH-T对人泌尿生殖系统肿瘤具有显著的体外和体内抑制作用，并与临床抗肿瘤药物DDP具有协同抗肿瘤作用，AMH在泌尿生殖系统肿瘤化学治疗药物开发方面具有良好的应用前景。AMH-T是松萝提取物中的总功效部位，是一个提取混合物，其中含有很多无作用的杂质成分，这些杂质成分对其抗癌功效和毒性可能具有较大影响，因此在后期的研究中，我们将进一步分离鉴定AMH-T中的抗癌功效化合物，并研究其对人类其他肿瘤的药效，进一步探讨其作用机制，为松萝的开发利用和抗癌新药的研发提供重要参考资料。

致谢    

感谢昆明医科大学天然药物研究中心和科研实验中心、云南省肿瘤研究所、香港科技大学生命科学部和中国科学院昆明植物研究所给予的帮助！