2. 宁波市医疗中心李惠利医院麻醉科, 浙江 宁波 315000 ;
3. 浙江大学医学院附属儿童医院实验检验中心, 浙江 杭州 310052
2. Department of Anesthesiology, Ningbo Medical Treatment Center Lihuili Hospital, Ningbo 315000, China ;
3. Clinical Research Center, the Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310052, China
脓毒症是宿主对感染的反应失调导致危及生命的器官功能障碍，是危重病患者死亡的主要原因之一[1-3]。脓毒症发病机制复杂，机体免疫细胞通过膜表面表达的多种受体介导免疫炎症反应参与脓毒症的发生和发展[4]。瞬时受体电位通道M2(transient receptor potential melastatin 2,TRPM2)是一种可渗透的钙离子通道受体[5]。最新研究发现，TRPM2基因敲除能明显降低巨噬细胞炎症因子的产生和巨噬细胞的吞噬功能，从而在脓毒症发生、发展过程中发挥重要作用[6]。但是，TRPM2基因的遗传变异是否与脓毒症的病理生理过程相关目前尚不清楚。因此，本文拟通过TRPM2常见单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)rs1556314的基因分型，探讨TRPM2的SNP与脓毒症易感性及患者预后的相关性。
1 对象与方法 1.1 对 象在浙江大学医学院附属第一医院ICU确诊为脓毒症的患者119例，诊断均符合美国危重病学协会制定的脓毒症诊断标准[1, 7]。排除标准为孕妇及年龄小于18岁、免疫缺陷、骨髓移植后、急性中毒等患者。记录入选者的急性生理与慢性健康评估Ⅱ(APACHE Ⅱ)评分以及脓毒症相关器官衰减(SOFA)评分。按照住院后28 d转归的不同将患者分为存活组和死亡组。对照组为112例外科大手术后未发生脓毒症的患者。本研究经浙江大学医学院附属第一医院伦理委员会批准，并获得患者知情同意。
1.2 基因型检测采用2 %乙二胺四乙酸二钠(EDTA)抗凝管收集脓毒症患者和对照组患者外周血5 mL，使用血液DNA提取试剂盒(德国Qiagen公司)严格按照说明书提取样本基因组DNA。基因型检测采用TaqMan实时PCR方法[8]，由上海基康生物技术有限公司完成。引物序列如下：正向引物5’-AAGCGGCTGCGTGAAGTC-3’，反向引物5’-TCTACCTGTACGAGAACCTGGACC-3’。TaqMan MGB 探针序列如下：野生型检测探针5’-HEX-CTCGG GaTCCTCC-MGB-3’，突变型检测探针5’-FAM-CTCGGGcTCCTCC-MGB-3’。TaqMan实时PCR的鉴定结果再经直接测序法进行再次验证。具体方法如下：先对包含该基因多态性位点的DNA片段进行PCR扩增，扩增体系包括50 ng基因组DNA，1.5 mmol 氯化镁，0.5 mmol的上下游引物，200 mmol dNTP，1U热启动Taq聚合酶和1×PCR缓冲液。上下游引物序列分别为5’-GTCTGGATCCCAGCCCTTC-3’和5’-TGCCTTAATCTGGGACTTCG-3’。PCR扩增条件为95 ℃预变性10 min；95 ℃ 变性10 s、56 ℃退火10 s和72 ℃延伸15 s，35次循环；最后72 ℃再延伸10 min。PCR产物经纯化后，将1 μL纯化产物与2 μL BigDye 3.1混合液(美国Applied Biosystems公司)和0.4 μmol上游引物进行扩增反应。扩增程序为96 ℃预变性1 min；28次循环的96 ℃变性10 s、50 ℃退火5 s和60 ℃延伸4 min。产物经乙醇纯化后，在ABI 3730测序分析仪(美国Applied Biosystems公司)进行序列分析。
1.3 统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，计量资料用均数±标准差(x±s)表示，计数资料用百分率表示，两组基因型和等位基因频率组间差异比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 脓毒症患者的临床特征119例脓毒症患者平均年龄(60.1±16.6)岁，男性54例(45.4%)，APACHE Ⅱ评分为20.4±7.5，SOFA评分为8.2±3.6，住院28 d存活患者57例(47.9%)。感染部位：肺部46例(38.7%)，腹部41例(34.5%)，置管部位15例(12.6%)，血行感染35例(29.4%)，其他部位(如创面、泌尿系统等)13例(10.9%)。感染微生物：革兰阳性菌感染45例(37.8%)，革兰阴性菌感染48例(40.3%)，真菌感染30例(25.2%)，病原菌不明确17例(14.3%)。对照组与脓毒症患者性别构成、平均年龄差异均无统计学意义(均P＞0.05)。
2.2 基因型分析本研究的所有对象都采用TaqMan实时PCR法获得基因分型结果。为证实上述鉴定结果的正确性，进一步采用直接测序法对上述结果进行验证，发现两种方法得到的鉴定结果完全一致(图 1)。这表明本研究采用 TaqMan实时PCR法得到的鉴定结果是可靠的。
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| 箭头所示处为rs1556314基因多态性位点 图 1 直接测序法验证基因分型结果 Fig. 1 Verification of genotypes using direct sequencing method |
脓毒症患者与对照组rs1556314的基因型TT、GT、GG和等位基因T、G分布频率差异均无统计学意义(均P＞0.05)，见表 1。脓毒症患者存活组与死亡组rs1556314的基因型TT、GT、GG和等位基因T、G分布频率差异均无统计学意义(均P>0.05)，见表 2。这些结果提示rs1556314与脓毒症患者的易感性及预后均无相关性。
| [n(%)] | |||||||
| 组别 | n | 基因型 | 等位基因 | ||||
| GG | GT | TT | T | G | |||
| 对照组 | 112 | 3(2.7) | 34(30.4) | 75(67.0) | 184(82.14) | 40(17.86) | |
| 脓毒症组 | 119 | 4(3.4) | 34(28.6) | 81(68.1) | 196(82.35) | 42(17.65) | |
| [n(%)] | |||||||
| 组别 | n | 基因型 | 等位基因 | ||||
| GG | GT | TT | T | G | |||
| 存活组 | 57 | 4(7.0) | 16(28.1) | 37(64.9) | 90(78.95) | 24(21.05) | |
| 死亡组 | 62 | 0(0.0) | 18(29.0) | 44(71.0) | 106(85.48) | 18(14.52) | |
脓毒症是环境因素和遗传因素等相互作用引发的一种复杂性疾病。遗传变异特别是基因单核参与了脓毒症的病理生理过程，与机体对感染的反应、易感性以及脓毒症的发展及转归密切相关[9-11]。既往已有从脓毒症的促炎/抑炎因子的角度进行遗传关联研究。TNF-α是脓毒症早期的关键促炎因子，TNF-α-308G/A是第一个发现且研究最多的与脓毒症相关的多态性位点。多项研究均证实TNF-α-308G/A与术后以及严重创伤所致的脓毒症相关，并增加脓毒症的死亡风险[12-13]；另外有研究表明，IL-6-174G/C、IL-10-1082G/A、IL-10、-592C/A以及IL-1受体相关激酶1(IRAK1)1595C与脓毒症相关[14-17]。也有研究从病原体识别角度，如Toll样受体(TLR)、脂多糖受体CD14、脂多糖结合蛋白和甘露糖结合凝集素等，进行脓毒症的遗传学分析[10],其中TLR和CD14研究较多。证实具有TLR1的rs5743551、rs4833095 SNP者患脓毒症休克和死亡的风险更高[18-20]；TLR4 +896A/G(Asp299Gly)是脓毒症休克的独立危险因素[21]；CD14-159C/T增加脓毒症休克的风险[22]。从溶血/纤溶系统角度，研究发现如纤溶酶原激活物抑制剂(PAI-l)4G/5G、蛋白C-1641A/-1654C 等多态性与脓毒症的易感性和严重程度密切相关[23-24]。
TRPM2是非选择性钙离子通道，作为氧化应激传感器，是调节机体氧化应激和炎症反应的重要分子[25-26]，在巨噬细胞表面呈固有表达，且脂多糖可以明显上调其表达水平[27]。研究表明，TRPM2对单核细胞炎症介质的释放和巨噬细胞的吞噬功能等有重要影响[26-31]。TRPM2基因敲除小鼠IFN-γ和IL-12产生减少，巨噬细胞活化减弱，不能有效清除入侵的李斯特菌，小鼠死亡率大幅度上升[28]。近期的一项研究发现，基因敲除TRPM2可能促进活性氧生成，从而加重脓毒症休克炎症反应和器官损伤[30]。因此，TRPM2可能在巨噬细胞介导炎症反应和吞噬病原微生物方面等功能中发挥重要作用，介导了脓毒症的发生发展。
TRPM2第11个外显子的同义突变位点rs1556314(Asp543Glu)是目前发现的位于TRPM2基因外显子区域的有较高最小等位基因频率的遗传变异，删除TRPM2第11号外显子(包含rs1556314位点)的一部分序列能降低TRPM2对ADP核糖体、过氧化氢等激活因子的反应，从而导致细胞钙离子参与的氧化应激反应动态平衡失调[32-33]。rs1556314的碱基改变与双向情感障碍和抑郁躁狂症明显相关[32-33]。本研究结果显示，TRPM2 rs1556314的基因型和等位基因分布频率在脓毒症组与对照组中无显著性差异，并且在脓毒症死亡患者与存活患者中也无显著性差异，与脓毒症易感性和预后均无相关性。其可能原因分析如下：首先，脓毒症受多种因素和多种基因影响，且同一基因也涉及多个位点的多态性，本研究仅是对TRPM2第11个外显子的rs1556314进行基因型分析，该位点可能与其邻近位点的SNP存在连锁不平稳，影响其对TRPM2表达的调节以及TRPM2在炎症反应中的调节作用；其次，等位基因分布在不同地区不同种族也是不一样的，本研究对象只纳入了汉族人群；也有可能由于本研究例数较少，不足以发现TRPM2基因SNP rs1556314对脓毒症易感性和预后的影响，因此，需扩大样本量进一步证实。
随着对脓毒症发病机制的认识增加，我们确信脓毒症是一个复杂的多因素疾病，其中遗传变异起到非常重要的作用。但是，脓毒症的遗传学相关性研究存在一些缺陷，如缺乏重复性研究，样本量不足，许多SNP功能重要性的理解不足，候补基因的选择依赖何种途径，SNP不是主要致病因素或与致病SNP存在高度的连锁不平衡等等。另外，已有证据表明，一些已经报道的脓毒症发病机制相关的多态性并不是功能性的，某些真正起作用的等位基因由于与相邻等位基因缺乏连锁尚未发现。这些研究缺陷在今后需进一步改进，如对参与脓毒症发生的相关基因同时存在的多个变异利用多变量方法进行分析，探索其在脓毒症发病中的作用，从而为脓毒症患者的个体化治疗和精准治疗提供可靠的遗传学依据。
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