2. 宁波大学医学院, 浙江 宁波 315040
2. Ningbo University School of Medicine, Ningbo 315040, China
喉癌是仅次于肺癌的第二大呼吸道高发癌，其发病率呈逐年上升趋势，喉鳞状细胞癌(laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC)为其主要病理类型[1]。手术切除是目前治疗喉癌的主要方式，但由于手术治疗中晚期喉癌的疗效及患者术后功能恢复有限，因此，需要寻找一种喉癌的早期诊断和治疗方法。近年研究表明，DJ-1基因在多种恶性肿瘤中异常表达，与肿瘤的发生、发展及预后密切相关[2]。DJ-1能调节抑癌基因PTEN的表达，从而促进肿瘤发展[3]。本课题组前期研究发现，DJ-1的小干扰RNA(siRNA)能显著抑制喉癌Hep-2细胞增殖，并与survivin基因表达相关[4]。为进一步阐明DJ-1与喉癌的相关性，本研究拟通过构建人喉癌裸鼠移植瘤模型，采用RNA干扰技术沉默DJ-1基因，观察移植瘤生长增殖及其survivin、PTEN表达的变化，探讨DJ-1基因对喉癌发生、发展的作用及其可能机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料细胞株：人喉癌Hep-2细胞株由浙江中医药大学实验动物中心提供。
实验动物：24只雄性BALB/cA nu/nu裸鼠，体质量14~16 g，SPF级，购于上海实验动物中心。实验动物使用许可证号SYXK(浙)2009-0123。
主要试剂：DJ-1 siRNA、转染试剂均购自北京英格恩生物科技有限公司。RNA提取试剂盒(德国QIAGENE公司)、逆转录试剂盒(德国QIAGEN公司)、引物探针、TaqMan®基因表达预混试剂(美国ABI公司)、荧光定量PCR试剂盒(美国ABI公司)、质粒提取试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)、DAB辣根过氧化物酶显影试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、BCA蛋白浓度试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)、免疫组织化学超敏SP试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)、一抗(英国Abcam公司)、二抗(英国Abcam公司)。
1.2 细胞培养人喉癌Hep-2细胞株用含10%FBS的RPMI 1640培养液，于37 ℃、5%二氧化碳孵箱内培养，以0.25%胰蛋白酶消化传代。取指数生长期的细胞用于实验。细胞接种于无菌培养皿中，扩增至足够数量后用于实验。
1.3 人喉癌裸鼠移植瘤模型的建立与分组裸鼠在浙江中医药大学SPF级裸鼠饲养系统饲养，所有饮用水、饲料及笼具均经无菌处理。取BALB/C裸鼠24只，均腋下皮下接种Hep-2细胞悬液0.2 mL(含细胞0.87×107)，待肿瘤生长达100 mm3以上，将符合实验条件的裸鼠随机分为三组：对照组、小剂量组、大剂量组，每组8只，分别给予5 %葡萄糖溶液、20 μg的DJ-1基因特异性siRNA、给予40 μg的DJ-1基因特异性siRNA。各组均向瘤体注射50 μL相应液体(表 1)，液体在每次注射前15 min配制，2次/周，连续21 d(共6次)。
| 组别 | 液体配制成分(50 μL/只) |
| 对照组 | DEPC水25 μL＋10 %葡萄糖25 μL |
| 小剂量组 | DEPC水12.5 μL＋DJ-1 siRNA(20 μg/8.5 μL DEPC水)4.25 μL＋转染试剂 8.25 μL＋10%葡萄糖25 μL |
| 大剂量组 | DJ-1 siRNA(40 μg/8.5 μL DEPC水)8.5 μL＋转染试剂16.5 μL＋10%葡萄糖25 μL |
参照文献[5]，从第7天开始，每周二用游标卡尺测量肿瘤最大长径(a)和横径(b)，记录数据直至实验结束。计算肿瘤体积：肿瘤体积(mm3)=1/2ab2。停药次日，颈椎脱臼法处死小鼠、剥离肿瘤组织、测量瘤体质量，计算各组抑瘤率(%)。抑瘤率=(对照组平均瘤体质量－给药组平均瘤体质量)/对照组平均瘤体质量×100%。剥离的肿瘤组织于-80 ℃保存。
1.5 免疫组织化学法检测Caspase-3和Ki-67的表达石蜡切片常规脱蜡，免疫组织化学染色按SP试剂盒说明书进行，采用PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性片作阳性对照。Caspase-3阳性产物定位于细胞质，呈棕黄色或出现棕褐色颗粒；Ki-67阳性产物定位于细胞核，呈棕黄色或棕褐色颗粒。主要步骤包括：切片脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复孵化、DAB显色液显色、苏木素复染、封片观察。采用人工半定量积分法进行综合评价判定结果[6]：根据阳性细胞数和着色深度计分，每例均随机选取癌细胞区(非坏死区)观察计数5个高倍视野(×400)，确定每个视野中阳性表达细胞数所占的比例，取其平均数即得该切片阳性细胞百分率，即阳性率。按下列梯度计分：无阳性细胞为0分，阳性细胞少于11%为1分，阳性细胞11%~50%为2分，阳性细胞51%~75%为3分，阳性细胞超过75%为4分；阳性细胞表达的DAB着色深度：基本不着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。
1.6 荧光定量RT-PCR检测DJ-1、survivin、PTEN基因mRNA表达裸鼠肿瘤组织总RNA用试剂盒提取，具体操作过程详见说明书，然后采用NanoDrop 2000微量紫外分光光度计测定RNA的浓度。cDNA通过逆转录反应获得，逆转录引物为随机引物N6，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。RT-PCR扩增采用TaqMan探针法，在荧光定量PCR仪ABI 7500上进行，引物、探针均由上海吉玛生物有限公司合成(表 2)。PCR反应程序：95 ℃变性3 min；95 ℃ 12 s，62 ℃ 40 s ，40个循环(检测survivin为36个循环)。相对表达量用Δct方法计算，先对每个组织标本的ct值进行测定，Δct(DJ-1、survivin、PTEN) = ct(DJ-1、survivin、PTEN) -ct(GAPDH)，取三次实验结果进行统计学分析。
| 基因名称 | 引物(5’-3’) | 探针(5’-3’) | 产物(bp) |
| DJ-1 | 正向：GACGGTCATCCCTGTAGATGTC，反向：GCTACACTGTACTGGGTCTTTTCC | AGCTGGGATTAAGGTCACCGTTGC | 88 |
| PTEN | 正向：TGTTGTTTCACAAGATGATGTTTG，反向：TATCTTCACCTTTAGCTGGCAGAC | AACTATTCCAATGTTCAGTGGCGGA | 97 |
| survivin | 正向：TCTTCTGCTTCAAGGAGCTGG，反向：ACCGGACGAATGCTTTTTATG | AGCCAGATGACGACCCCATAGAGGA | 92 |
| GAPDH | 正向：CATGAGAAGTATGACAACAGCCT，反向：AGTCCTTCCACGATACCAAAGT | TCCTGCACCACCAACTGCTTAGCACC | 113 |
裸鼠组织剪碎研磨后，用放射免疫沉淀(RIPA)缓冲液裂解，收集上清液，所有过程按照说明进行处理，制备细胞总蛋白提取液。用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白总浓度，加入适量的5×SDS-PAGE上样缓冲液，混匀，煮沸5 min变性。取约30 μg的总蛋白在SDS-PAGE上120 V分离1 h，然后恒压60 V 2 h转移至PVDF膜上(美国Millipore公司产品)，用TBST溶解的5% BSA封闭液4 ℃冰箱封闭，在水平摇床上用TBST清洗膜三次，每次5 min。将膜分别置于稀释的DJ-1(1∶200)、survivin(1∶500)、PTEN(1∶100)、GAPDH(1∶800)单克隆抗体反应液中，室温水平摇动1 h，TBST洗膜三次，每次5 min。将二抗用5% BSA的封闭液稀释至适当浓度1∶10 000，将洗净的膜放在二抗稀释液中，室温下孵育1 h后，再用TBST缓冲液在脱色摇床上室温洗三次，每次5 min。取DAB辣根过氧化物酶显影试剂盒中的A和B两种试剂在避光盒中等体积混合，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触，5~10 min后观察蛋白条带，并用去离子水终止反应。用凝胶成像仪扫描拍摄图片。
1.8 统计学方法数据采用SPSS 17.0软件分析，符合正态分布的计量资料以均数±标准差(x±s)表示，两样本均数比较采用独立样本t检验，多组比较采用单因素方差分析，各组裸鼠移植瘤的生长曲线比较采用重复测量设计的方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 三组瘤体体积及质量比较如图 1A所示，观察期间各组裸鼠移植瘤体积均增大，小剂量组和大剂量组第9天开始瘤体减小。直至实验结束，小剂量组和大剂量组的抑瘤率分别为(20.48±0.18)%和(42.16±0.13)%，与对照组(0.00±0.26)%比较差异均有统计学意义(均P<0.05)，而小剂量组与大剂量组比较差异无统计学意义(P>0.05)。观察解剖的移植瘤，小剂量组瘤体较小，大剂量组瘤体更小，呈球形，淡红色，质软；瘤体质量小剂量组(0.66±0.15)g和大剂量组(0.48±0.11)g均小于对照组(0.83±0.16)g，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见图 1B。
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| A：三组移植瘤的生长曲线比较.与对照组比较，*P < 0.05；B：三组移植瘤大体标本比较.与对照组比较，小剂量组和大剂量组瘤体较小，大剂量组更明显，呈球形，淡红色. 图 1 三组瘤体体积比较 Fig. 1 The inhibition of DJ-1 siRNA on the growth of LSCC xenograft model |
Caspase-3基因表达阳性染色主要定位于细胞质中，为粗细不一的棕黄色颗粒。对照组中被染棕黄色颗粒较少，小剂量组和大剂量组中较多，见图 2。Caspase-3在对照组、小剂量组、大剂量组的阳性率分别为25.0%(2/8)、62.5%(5/8)、75.0%(6/8)，差异均有统计学意义(均P<0.05)，表明Caspase-3能促进肿瘤细胞凋亡。
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| A：对照组在细胞质中的棕黄色颗粒较少(如箭头所示)；B：小剂量组在细胞质中棕黄色颗粒较多(如箭头所示)，细胞破裂也较多；C：大剂量组棕黄色颗粒在细胞质中更多(如箭头所示).SP染色，标尺=250 μm. 图 2 免疫组织化学检测各组Caspase-3的表达 Fig. 2 The expression of Caspase-3 in tumor specimens by immunohistochemistry |
Ki-67基因表达阳性染色主要定位于细胞核中，为大小不一的棕黄色颗粒。对照组棕黄色颗粒较多，小剂量组部分细胞核被染色，而大剂量组细胞核很少见到棕黄色颗粒，见图 3。Ki-67在对照组、小剂量组和大剂量组的阳性率分别为100.0%(8/8)、50.0%(4/8)、37.5%(3/8)，小剂量组和大剂量组Ki-67表达减少(P<0.05)，大剂量组减少更明显，差异均有统计学意义(均P<0.05)，表明Ki-67能抑制肿瘤细胞增殖。
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| A：对照组细胞核中棕黄色颗粒很多(如箭头所示)；B：小剂量组细胞核中棕黄色颗粒减少(如箭头所示)；C：大剂量组细胞核中棕黄色颗粒明显减少(如箭头所示)，且部分细胞破裂.SP染色，标尺=250 μm. 图 3 免疫组织化学检测各组Ki-67的表达 Fig. 3 The expression of Ki-67 in tumor specimens by immunohistochemistry |
与对照组比较，DJ-1和survivin mRNA表达小剂量组、大剂量组减少，且大剂量组比小剂量组表达更少，差异均有统计学意义(均P < 0.05)。而与DJ-1和survivin相反，PTEN mRNA表达小剂量组、大剂量组增多，与对照组比较，差异均有统计学意义(均P < 0.05)，见图 4。
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| 与对照组比较，*P < 0.05. 图 4 三组DJ-1、survivin、PTEN mRNA表达比较 Fig. 4 DJ-1,survivin and PTEN mRNA expression in experimental and control groups |
与对照组比较，DJ-1和survivin蛋白表达小剂量组、大剂量组均减少(均P < 0.05)，而大剂量组与小剂量组表达差异无统计学意义(P＞0.05)。与DJ-1和survivin相反，PTEN蛋白表达小剂量组、大剂量组增多，与对照组差异均有统计学意义(均P < 0.05)，见图 5。
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| A：三组DJ-1、PTEN、survivin表达的蛋白质免疫印迹图；B：三组DJ-1、PTEN、survivin蛋白相对表达量比较.与对照组比较，*P < 0.05. 图 5 三组DJ-1、survivin和PTEN蛋白的表达 Fig. 5 Western blot results of the expression of DJ-1,survivin and PTEN in experimental and control groups |
近年来，手术结合放疗、化疗等综合措施使喉癌患者5年存活率有所提高，但喉癌的复发、转移、放疗抵抗及化学药物耐受等问题仍是患者死亡的主要原因[1]。恶性肿瘤的发生、发展与癌基因的异常扩增以及抑癌基因的突变、缺失或低表达等密切相关[7]。我们前期在体外采用RNA干扰沉默喉癌Hep-2细胞株的DJ-1基因，发现Hep-2细胞的生长和增殖显著抑制[4]，本研究则在体内水平探讨DJ-1基因对喉癌裸鼠移植瘤生长的抑制作用。
前期研究发现，与其他恶性肿瘤类似，DJ-1基因在喉癌临床标本中也呈现高表达，且与survivin基因的表达呈正相关[8]。在喉癌Hep-2细胞株中，下调DJ-1基因的表达，能显著抑制喉癌细胞的生长[4]。为了进一步阐明DJ-1基因在喉癌发生发展过程中的作用，本研究建立了喉癌裸鼠移植瘤的动物模型，并采用RNA干扰技术沉默DJ-1基因的表达。我们发现与体外研究结果类似，DJ-1基因干扰(小剂量组和大剂量组)的裸鼠瘤体生长均慢于对照组，移植瘤大小及质量均小于对照组，且大剂量组比小剂量组效果更明显；凋亡相关Caspase-3基因表达多于对照组，而生长增殖相关Ki-67基因表达低于对照组，证实了DJ-1 siRNA对喉癌细胞生长抑制和促进凋亡作用，与体外实验的结果相符。
DJ-1基因是Nagakubo等[9]在1997年发现的一种新的丝裂原依赖性癌基因，近年研究发现，DJ-1在各种肿瘤如胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、肝癌、宫颈癌等多种肿瘤组织中高表达，并发现其与恶性肿瘤的发展及预后等密切相关[10-12]，但其作用机制尚不明确。有研究显示，DJ-1基因通过调节PTEN基因对磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt/mTOR通路产生促进作用而使多种解毒酶增多，形成一个利于细胞生长的微环境，促进细胞不断增殖、生长[13]。
PTEN基因是一个具有双重特异磷酸酶活性的抑癌基因。在生长因子的刺激下，细胞中的PI3K能够被激活并磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)生成三磷酸磷脂酰肌醇3(PIP3)，PIP3 能引起蛋白激酶(PDK)的聚集并磷酸化激活激酶PKB/Akt，形成利于细胞生长的微环境而促进细胞生长和增殖。而PTEN基因能抑制PIP2的磷酸化，以减少PIP3的生成，阻断PKB/Akt通路的激活，抑制细胞的生长和增殖[14]。
基于上述结果，我们推测DJ-1 siRNA对喉癌Hep-2裸鼠移植瘤的生长有抑制作用。为了进一步探索DJ-1 siRNA在裸鼠移植瘤内可能的作用机制，我们分别检测了剥离的移植瘤的相关基因如DJ-1、survivin、PTEN基因 mRNA及其蛋白的表达，研究结果显示，DJ-1基因干扰后DJ-1和survivin的mRNA及蛋白表达水平低于对照组，且大剂量组比小剂量组抑制作用更显著，而PTEN的表达却相反，其mRNA和蛋白表达均高于对照组，这与喉癌Hep-2细胞的研究结果也是一致的[4]。
综上所述，DJ-1 siRNA能显著抑制喉癌Hep-2裸鼠移植瘤模型的生长及增殖，其作用途径可能如下：一方面下调了DJ-1和survivin基因的表达，促进细胞凋亡；另一方面释放了PTEN基因，阻断PI3K-PKB/Akt通路的激活，从而抑制细胞的生长和增殖。本研究结果为DJ-1 siRNA作为新的抗肿瘤药物提供了新的依据。
| [1] | 沈志森, 詹国文, 邓红霞, 等. 微小RNA-519b-3p对人喉癌Hep-2细胞增殖的抑制作用及其机制[J]. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2014, 49 (2) : 151–155. SHEN Zhisen, ZHAN Guowen, DENG Hongxia, et al. Growth inhibitory effect of microRNA-519b-3p on larynx squamous Hep-2 cells[J]. Chinese Journal of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, 2014, 49 (2) :151–155. (in Chinese) |
| [2] | 李雷激, 刘跃华, 高琳, 等. 凋亡基因Survivin, P53, Bcl-2和Bax在喉癌组织中的表达及与放疗的敏感性[J]. 泸州医学院学报, 2015, 38 (4) : 401–404. LI Leiji, LIU Yuehua, GAO Lin, et al. Relationship between the expression of Survivin, P53, Bcl-2 and Bax, and radiosensitivity in laryngeal carcinoma[J]. Journal of Luzhou Medical College, 2015, 38 (4) :401–404. (in Chinese) |
| [3] | 方茅, 翁泽平, 关弘, 等. 三阴性乳腺癌组织DJ-1和PTEN及AR表达与预后相关性分析[J]. 中华肿瘤防治杂志, 2013, 20 (10) : 761–764. FANG Mao, WENG Zeping, GUAN Hong, et al. Expression of DJ-1, PTEN and AR in triple-negative breast cancer and its correlation with relative clinical parameters and prognosis[J]. Chinese Journal of Cancer Prevention and Treatment, 2013, 20 (10) :761–764. (in Chinese) |
| [4] | SHEN Z, JIANG Z, YE D, et al. Growth inhibitory effects of DJ-1-small interfering RNA on laryngeal carcinoma Hep-2 cells[J]. Med Oncol, 2011, 28 (2) :601–607. doi:10.1007/s12032-010-9474-7 |
| [5] | BELLAMKONDA K, CHANDRASHEKAR N K, OSMAN J, et al. The eicosanoids leukotriene D4 and prostaglandin E2 promote the tumorigenicity of colon cancer-initiating cells in a xenograft mouse model[J]. BMC Cancer, 2016, 16 :425. doi:10.1186/s12885-016-2466-z |
| [6] | 陈建华, 范钦和, 丛玲华, 等. Livin在乳腺癌中的表达及其与Caspase-3, Ki67表达的关系[J]. 江苏大学学报(医学版), 2007, 17 (5) : 415–418. CHEN Jianhua, FAN Qinhe, CONG Linghua, et al. Expression of Livin in breast carcinoma and its relationship with Caspase-3 and Ki67[J]. Journal of Jiangsu University (Medicine Edition), 2007, 17 (5) :415–418. (in Chinese) |
| [7] | 叶栋, 沈志森. DJ-1基因在肿瘤中的研究进展[J]. 中国医学创新, 2010, 7 (8) : 155–157. YE Dong, SHEN Zhisen. The research progress of DJ-1 in tumor[J]. Medical Innovation of China, 2010, 7 (8) :155–157. (in Chinese) |
| [8] | SHEN Z, REN Y, YE D, et al. Significance and relationship between DJ-1 gene and surviving gene expression in laryngeal carcinoma[J]. Eur J Histochem, 2011, 55 (1) :e9. doi:10.4081/ejh.2011.e9 |
| [9] | NAGAKUBO D, TAIRA T, KITAURA H, et al. DJ-1, a novel oncogene which transforms mouse NIH3T3 cells in cooperation with ras[J]. Biochem Biophys Res Commun, 1997, 231 (2) :509–513. doi:10.1006/bbrc.1997.6132 |
| [10] | KURAMITSU Y, BARON B, YOSHINO S, et al. Proteomic differential display analysis shows up-regulation of 14-3-3 sigma protein in human scirrhous-type gastric carcinoma cells[J]. Anticancer Res, 2010, 30 (11) :4459–4465. |
| [11] | BARUA A, EDASSERY S L, BITTERMAN P, et al. Prevalence of antitumor antibodies in laying hen model of human ovarian cancer[J]. Int J Gynecol Cancer, 2009, 19 (4) :500–507. doi:10.1111/IGC.0b013e3181a39db1 |
| [12] | ZENG H Z, QU Y Q, ZHANG W J, et al. Proteomic analysis identified DJ-1 as a cisplatin resistant marker in non-small cell lung cancer[J]. Int J Mol Sci, 2011, 12 (6) :3489–3499. |
| [13] | SITARAM R T, CAIRNEY C J, GRABOWSKI P, et al. The PTEN regulator DJ-1 is associated with hTERT expression in clear cell renal cell carcinoma[J]. Int J Cancer, 2009, 125 (4) :783–790. doi:10.1002/ijc.v125:4 |
| [14] | 肖冠英, 赵宋礼, 苏展敏, 等. DJ-1、PTEN的表达与良性脑膜瘤复发和演进的关系[J]. 中国医学工程, 2015, 23 (9) : 12–15. XIAO Guanying, ZHAO Songli, SU Zhanmin, et al. The relationship between the DJ-1, PTEN expression and recurrence and evolution of benign meningiomas[J]. Chinese Medical Engineering, 2015, 23 (9) :12–15. (in Chinese) |