神经酰胺(Ceramide)是鞘脂代谢的重要中间产物，存在于所有的真核细胞中，由一个偶数链脂肪酸(2～28个碳)通过酰胺键与鞘氨醇基团连接而成[1](见图 1)。神经酰胺是细胞膜的重要结构成分，同时也是细胞内的第二信使[2]，参与调控细胞的生长、增殖、分化、衰老和凋亡[3, 4, 5]。
|
| 图 1 神经酰胺的结构式 Fig.1 The structure of ceramide |
近年研究显示，细胞内不同类型的神经酰胺可发挥不同甚至相反的作用[6, 7, 8]，同时测定生物样品中各种神经酰胺的含量对研究神经酰胺的生物学效应机制具有重要意义。然而，由于神经酰胺本身的复杂性和检测过程的烦冗，长期以来缺少一种快速、有效且能大规模定性和定量检测神经酰胺的方法。而以往文献报道中，神经酰胺的分析基本局限于总体水平或某一种神经酰胺，很少涉及同时分类检测组织或细胞内几种神经酰胺的含量[9, 10, 11]。针对这一现况，本研究采用高效液相色谱串联质谱法(high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS)的多反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式探索同时测定细胞提取物中不同类型神经酰胺的含量，为神经酰胺提取物质量评价和控制提供分析手段，同时为全面分析细胞内神经酰胺的含量提供技术支持。
1 材料与方法 1.1 主要试剂及仪器C16、C17、C18、C24四种神经酰胺标准品购自美国Avanti公司；甲酸铵、甲酸、甲醇、异丙醇和乙酸乙酯，试剂均为色谱纯，购自国药集团上海化学试剂有限公司。Agilent 1290高效液相色谱仪购自美国安捷伦公司；全自动多功能酶标仪购自美国赛默飞世尔科技公司；超声波细胞粉碎仪器购自美国Sonics公司；冷冻干燥与离心浓缩系统购自美国Labconco公司；高速离心机购自美国Sorvall公司。
1.2 色谱和质谱参数条件及系统适应性色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C8(150 mm×2.1 mm，3.5 μL)色谱柱；柱温35 ℃，进样量10 μL。流动相：A相(含1 mmol/L甲酸铵和0.2%甲酸的甲醇溶液)，B相(100%甲醇)，流速为0.3 mL/min，洗脱时间为35 min。流动相梯度(A/B)变化如下：0～20 min，20/80～1/99；20～35 min，1/99～0/100。质谱参数见表 1。
| 神经酰胺类型 | 离子对(m/z) | 保留时间(min) | 碰撞能量(eV) |
| C17 | 552.5-264.3 | 17.119 | 22 |
| C16 | 538.5-264.3 | 16.658 | 25 |
| C18 | 566.5-264.3 | 17.636 | 25 |
| C24 | 650.6-264.3 | 20.089 | 30 |
各取5 mg C16、C17、C18、C24四种神经酰胺标准品，加入甲醇，混匀，超声处理10 min，使其彻底溶解，配成不同浓度的神经酰胺标准品储备液(C24神经酰胺的储备液质量浓度为1.25 mg/mL，其他3种均为2.50 mg/mL)，分装后置于－20 ℃ 冰箱保存备用，使用时根据不同浓度需要进行稀释。吸取各神经酰胺标准品储备液，用甲醇稀释，制备低(0.1 μg/mL)、中(0.5 μg/mL)、高(1.0 μg/mL)3个质量浓度的对照品混合溶液(4种神经酰胺的混合溶液)。另外，吸取各神经酰胺标准品储备液，用甲醇稀释，配制成质量浓度为0.5 μg/mL的供试品混合溶液(4种神经酰胺的混合溶液)。
吸取各神经酰胺标准品储备液，用甲醇分步稀释，制备标准曲线系列溶液；C24、C18、C17、C16四种神经酰胺的混合溶液的质量浓度梯度为0.10、0.30、0.50、0.75、1.00 μg/mL；后期根据人羊膜成纤维细胞(FL细胞)内C18神经酰胺的含量范围，对C18神经酰胺作了新的标准曲线系列溶液，其质量浓度梯度为1.0、10.0、20.0、40.0、80.0 ng/mL。按相同色谱条件分别测定各浓度溶液中神经酰胺含量。平行制备6份供试品混合溶液，每份溶液按相同色谱条件测定，记录峰面积，外标法计算含量，验证重复性。平行制备9份供试品混合溶液，每3份为一组，按低、中、高3个水平分别加入神经酰胺的对照品混合溶液，按相同色谱条件测定，记录峰面积，代入标准曲线，按外标法计算含量，计算加样回收率。平行制备6份制备供试品混合溶液，在室温条件下放置24 h后按相同色谱条件测定，记录峰面积，外标法计算含量，与0时比较，验证样品稳定性。
1.4 细胞培养FL细胞为本实验室库存细胞，于含10% FBS的MEM培养液中培养。FL细胞以2×105/mL的密度接种在60 mm的细胞培养皿上，每皿5 mL，置于37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养。
1.5 细胞脂类提取将细胞置于冰上，弃去培养液，用预冷的PBS清洗两次；在培养皿中加入2 mL预冷PBS，用刮棒刮取细胞，转移至离心管，4 ℃ 2 000×g离心10 min，收集细胞，重复上述步骤；加入200 μL PBS，重悬，超声(持续3 s，停3 s，循环3次)处理细胞，结束后4 ℃ 2 000×g离心10 min，取上清液2 μL，用BCA法测定蛋白浓度；然后加入10 μL浓度为50 μg/mL的C17神经酰胺标准品(内标)，混匀后加入1.8 mL的提取液A(异丙醇∶乙酸乙酯体积比=1∶2)，混匀，超声(持续3 s，停3 s，循环10 次)，4 ℃ 2 000×g离心10 min，将上清液转移到新的离心管；在原来的离心管中加入2 mL提取液B(异丙醇︰乙酸乙酯︰双蒸水体积比=3∶6∶1)，重复上述步骤；将两次上清液混合(共4 mL)，置于冷冻干燥与浓缩离心系统抽干；最后加1 mL甲醇定容，充分混匀后检测[11, 12]。
1.6 FL细胞内神经酰胺的测定 1.6.1 定性分析对FL细胞的脂类提取样品进行母离子模式全扫描，根据神经酰胺的相对分子量大小将前体离子范围设定在质荷比为300～1000，通过得到的化合物的准分子离子判断化合物的相对分子量，从而筛选可能存在的神经酰胺种类；通过与相应的神经酰胺标准品质谱结果进行比对，最后确认FL细胞内存在的神经酰胺类型。
1.6.2 定量分析提取6份FL细胞脂类样品，按相同色谱条件进行神经酰胺测定，记录峰面积。先计算外加C17神经酰胺(内标，总量为1 μg)的回收率，以此作为神经酰胺的提取率，然后用C17神经酰胺的回收率调整其他神经酰胺的峰面积。然后将调整后的峰面积代入各自的标准曲线，按外标法计算每种神经酰胺的含量，最后用总蛋白含量(mg/mL)进行标化，获得FL细胞内每种神经酰胺的含量，单位为μg/mg蛋白。
1.7 统计学方法各浓度溶液按相同色谱条件测定，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标进行线性回归分析。实验数据采用Excel 2013及SPSS 20.0统计软件进行分析，运用方差分析法比较不同神经酰胺含量差异，P＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结 果 2.1 方法学验证C16、C17、C24神经酰胺在0.02～1.0 μg/mL浓度范围内均呈现良好的线性关系，C18神经酰胺在0.001～1.0 μg /mL内也有良好的线性关系，见表 2。
| 神经酰胺类型 | 回归方程 | 线性相关系数(R2) |
| C16 | A=22.017C－0.6508 | 0.9989 |
| C17 | A=18.901C－0.4122 | 0.9996 |
| C18 | A=20.197C－0.0292 | 0.9998 |
| C24 | A=25.262C+0.0898 | 0.9998 |
C16、C17、C18、C24四种神经酰胺在0.5 μg/mL浓度处6次峰面积的相对标准偏差(RSD)值分别为3.2%、3.0%、2.9%、4.0%，表明本系统精密度良好。C16、C17、C18、C24四种神经酰胺平均回收率分别为99.1%、99.9%、100.5%、98.2%，RSD分别为5.6%、5.1%、4.8%、5.5%，表明该方法准确度好(见表 3)。样品于室温放置24 h后测定的含量与0时比较，四种神经酰胺含量的精密度的RSD值分别为4.0%、4.2%、4.1%、2.8%，表明四种神经酰胺室温放置24 h内稳定性良好。
|
神经酰胺 类别 | 本底值 (μg) | 加入值 (μg) | 测得均值 (μg) | 平均回收率 (%，n=3) |
|
C16 | 0.050 0.250 0.500 | 0.250 0.250 0.250 | 0.279 0.502 0.780 | 92.9 100.4 104.0 |
| C17 | 0.050 0.250 0.500 | 0.250 0.250 0.250 | 0.283 0.508 0.779 | 94.3 101.7 103.9 |
| C18 | 0.050 0.250 0.500 | 0.250 0.250 0.250 | 0.285 0.515 0.777 | 95.0 103.0 103.6 |
| C24 | 0.050 0.250 0.500 | 0.250 0.250 0.250 | 0.286 0.519 0.716 | 95.4 103.8 95.5 |
采用母离子扫描模式对FL细胞的脂类提取样品进行扫描分析，获得母离子扫描模式下的总离子流图(见图 2)。根据总离子流图提取到的相应质量色谱图(又称提取离子色谱图，见图 3)及神经酰胺标准品的质谱参数(见表 1)，确定在本实验条件下FL细胞内存在C16(前体离子质荷比为538.3)、C18(前体离子质荷比为566.3)、C24 (前体离子质荷比为650.5)三种神经酰胺。
|
| 图 2 母离子扫描模式下的总离子流图 Fig.2 Total ion chromatogram composed from PIS analysis of ceramides |
|
| 图 3 不同类型的神经酰胺样品HPLC-MS提取离子色谱图 Fig.3 Extraction chromatogram of ceramides |
在脂类提取过程中，外加C17神经酰胺的回收率即神经酰胺提取率为(94.84±6.89)%。6份FL细胞独立样品中C16、C18、C24三种神经酰胺的测定结果见表 4。
| (μg/mg蛋白) | |||
| 样品 | C16 | C18 | C24 |
| 1 | 0.128 | 0.026 | 0.211 |
| 2 | 0.104 | 0.016 | 0.166 |
| 3 | 0.108 | 0.016 | 0.170 |
| 4 | 0.112 | 0.016 | 0.148 |
| 5 | 0.092 | 0.014 | 0.147 |
| 6 | 0.101 | 0.016 | 0.126 |
结果表明，在FL细胞中，C24神经酰胺含量[(0.161±0.029) μg/mg 蛋白]最高，C16神经酰胺含量[(0.107±0.012) μg/mg 蛋白]次之，C18神经酰胺含量[(0.017±0.004) μg/mg蛋白]最低(P＜0.05)。提示FL细胞内三种神经酰胺的含量相对稳定。
3 讨 论目前，用于检测神经酰胺的方法主要包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、二酯酰甘油(DAG)试验、质谱法和HPLC-MS法。其中TLC、HPLC和DAG试验都存在灵敏度和分辨率不高的问题，且前期处理复杂，耗时耗力，需要的样品量大，难以大规模应用于生物定量分析。 质谱法，如电喷雾电离质谱法，虽然灵敏度高、所需样品少且用时较短，但由于可能出现质量数重叠的脂质分子之间的相互干扰，导致其检测特异性不佳。而本研究结果表明，采用HPLC-ESI-MS法在多反应检测模式下定量分析神经酰胺具有灵敏度高，重复性好，快速、准确的优点，并且不需要对样品进行衍生化处理，适用于神经酰胺提取物的定量分析。此外，关于神经酰胺含量的标化及比较也是实验研究所关注的问题。利用HPLC-ESI-MS法所获得的结果代表的是样品中每种神经酰胺的总量。在没有标化的情况下，各组样品间的神经酰胺含量其实不具有可比性。因此质谱分析所得实验结果(即神经酰胺含量)需要选择一个稳定的参数进行标准化后才能进行统计分析。细胞总蛋白量和细胞总数因可代表生物样品的总量而常被用作标化参数[12]。本方法采用细胞总蛋白量作为标化参数，以每毫克蛋白所对应的神经酰胺含量来量化细胞内的神经酰胺。实验结果表明，该指标具有较好的稳定性，可为细胞内神经酰胺的定量分析和比较提供参考。
| [1] | KOLESNICK R N, GONI F M, ALONSO A. Compartmentalization of ceramide signaling: physical foundations and biological effects[J]. J Cell Physiol,2000,184(3):285-300. |
| [2] | VAN BLITTERSWIJK W J,VAN DER LUIT A H, VELDMAN R J, et al. Ceramide: second messenger or modulator of membrane structure and dynamics?[J]. Biochem J, 2003,369(Pt 2):199-211. |
| [3] | GEILEN C C, WIEDER T, ORFANOS C E. Ceramide signalling: regulatory role in cell proliferation, differentiation and apoptosis in human epidermis[J]. Arch Dermatol Res, 1997,289(10):559-566. |
| [4] | OBEID L M, LINARDIC C M, KAROLAK L A, et al. Programmed cell death induced by ceramide[J]. Science, 1993,259(5102):1769-1771. |
| [5] | VENABLE M E, LEE J Y, SMYTH M J, et al. Role of ceramide in cellular senescence[J]. J Biol Chem, 1995,270(51):30701-30708. |
| [6] | SENKAL C E, PONNUSAMY S, ROSSI M J, et al. Role of human longevity assurance gene 1 and C18-ceramide in chemotherapy-induced cell death in human head and neck squamous cell carcinomas[J]. Mol Cancer Ther, 2007,6(2):712-722. |
| [7] | SENKAL C E, PONNUSAMY S, BIELAWSKI J, et al. Antiapoptotic roles of ceramide-synthase-6-generated C16-ceramide via selective regulation of the ATF6/CHOP arm of ER-stress-response pathways[J]. FASEB J, 2010,24(1):296-308. |
| [8] | SASSA T, SUTO S, OKAYASU Y, et al. A shift in sphingolipid composition from C24 to C16 increases susceptibility to apoptosis in HeLa cells[J]. Biochim Biophys Acta, 2012,1821(7):1031-1037. |
| [9] | LIEBISCH G, DROBNIK W, REIL M, et al. Quantitative measurement of different ceramide species from crude cellular extracts by electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-MS/MS)[J]. J Lipid Res, 1999,40(8):1539-1546. |
| [10] | HAYNES T A, DUERKSEN-HUGHES P J, FILIPPOVA M, et al. C18 ceramide analysis in mammalian cells employing reversed-phase high-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Anal Biochem, 2008,378(1):80-86. |
| [11] | KASUMOV T, HUANG H, CHUNG Y M, et al. Quantification of ceramide species in biological samples by liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry[J]. Anal Biochem, 2010,401(1):154-161. |
| [12] | BIELAWSKI J, SZULC Z M, HANNUN Y A, et al. Simultaneous quantitative analysis of bioactive sphingolipids by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Methods, 2006,39(2):82-91. |