2. 蚌埠医学院生物科学系, 安徽 蚌埠 233000;
3. 蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室, 安徽 蚌埠 233000
2. Department of Bioscience, Bengbu Medical College, Bengbu 233000, China;
3. Department of Biochemistry & Molecular Biology, Bengbu Medical College, Bengbu 233000, China
乳腺癌已成为我国女性最常见的恶性肿瘤之一。紫杉醇为治疗乳腺癌的一线药物，对进展期乳腺癌具有显著的抗肿瘤活性，可提高新辅助化疗的疗效。但是乳腺癌化疗耐受导致化疗失败仍然是乳腺癌治疗中的一个巨大障碍。乳腺癌患者微小RNA(microRNA，miRNA或miR)的差异表达与淋巴结转移、雌激素受体或人类表皮生长因子受体2表达、化疗耐药等生物学行为相关[1, 2, 3]。研究发现miR-21与乳腺癌的临床分期、病理分级、激素受体等生物学指标密切相关[4]。本研究通过建立人乳腺癌细胞株MCF-7和SKBR-3的紫杉醇耐药株，检测miR-21在MCF-7和SKBR-3亲本和耐药株中的表达差异，并进一步分析miR-21对紫杉醇耐药的影响及相关机制，为临床逆转耐药、提高辅助化疗效果提供依据。
1 材料与方法 1.1 材 料人乳腺癌细胞株MCF-7、SKBR-3购自中国科学院细胞库；紫杉醇、MTT、二甲基亚砜(DMSO)、焦碳酸二乙酯(DEPC)购自美国Sigma公司；Trizol、Lipofectamine 2000及Opti-DMEM购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒购自美国Fermentas公司；鼠抗人P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)、Bcl-2、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠IgG购自北京中杉金桥生物公司；细胞凋亡试剂盒购自美国BD公司；聚偏氟乙烯(PVDF)膜、ECL化学发光试剂盒购自美国Millipore公司；has-miR-21及人源snRNA U6均购自广州复能基因有限公司；miR-21 抑制剂(5′-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3′)和模拟物(正义链5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3′，反义链5′-AACAUCAGUCUGAUAAGCUAUU-3′)购自上海吉玛制药技术有限公司；多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated protein，MRP)1、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、多药耐药基因1(multidrug resistance 1，MDR1)和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)基因的引物由南京金斯瑞生物科技公司合成；逆转录试剂盒购自美国Thermo Scientific公司；荧光定量PCR试剂盒购自日本Takara公司；一步法miRNA定量逆转录PCR试剂盒购自美国GeneCopoeia公司；凋亡试剂盒购自德国Merck Millipore公司。
1.2 细胞培养及形态学观察人乳腺癌细胞株MCF-7、SKBR-3培养于含10% FBS的RPMI 1640培养液中，置于37 ℃、5% 二氧化碳饱和湿度的培养箱中，每3天传代一次，以下实验均采用对数生长期细胞。用倒置显微镜观察细胞形态学的变化。
1.3 MTT法检测紫杉醇对MCF-7、SKBR-3细胞生长抑制浓度0.25%胰酶消化MCF-7、SKBR-3细胞，调整细胞密度为1×105／mL，每孔100 μL接种于96孔板中；37 ℃、5% 二氧化碳培养箱中培养，24 h后加入含紫杉醇的培养液100 μL，设置药物浓度梯度(MCF-7细胞分别为0.001、0.01、0.1、1、10、100 μmol／L；SKBR-3细胞分别为0.01、0.1、1、10、50 μmol／L)，每一浓度设置5个复孔，同时设置不加药物的对照组，继续培养72 h；每孔加入5 mg／mL MTT液20 μL，继续培养4 h后轻轻吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，微量振荡器振荡10 min，用酶标仪检测490 nm处各孔的吸光度值；以空白孔调零，计算细胞生长抑制率。生长抑制率(%)=(1-实验组平均吸光度值／对照组平均吸光度值)×100%；根据生长抑制率计算半数抑制浓度(IC50)，每组实验独立重复3次。
1.4 建立人乳腺癌紫杉醇耐药细胞株MCF-7／PR和SKBR-3／PRMCF-7、SKBR-3细胞融合度为70%～80%时，以1 μmol／L为起始浓度的紫杉醇作用于细胞；培养24 h后撤药，继续常规培养，待细胞恢复稳定生长后再添加同一浓度药物，培养24 h撤药；继续培养至生长良好且稳定时进行浓度逐步递增性诱导，历经6个月建立乳腺癌紫杉醇耐药细胞株MCF-7／PR和SKBR-3／PR。MCF-7／PR细胞在含10 μmol ／mL紫杉醇培养液中稳定生长，SKBR-3／PR细胞在含25 μmol／mL紫杉醇培养液中稳定生长。
1.5 细胞转染miR-21 抑制剂和模拟物将miR-21 抑制剂转染MCF-7／PR和SKBR-3／PR细胞，miR-21 模拟物转染MCF-7和SKBR-3细胞。实验分为4组：miR-21 抑制剂组、miR-21 模拟物组、 阴性对照组和空白对照组。阴性对照组为不引起细胞内基因改变的基因片段加脂质体Lipofectamine 2000转染细胞；空白对照组细胞仅转染脂质体。具体操作步骤如下：0.25%胰酶消化对数生长期的耐药或亲本细胞，6孔板中每孔接种4×105／mL细胞，第2天细胞贴壁达到70%～80%；将5 μL 浓度为20 μmol／L的miR-21 抑制剂或miR-21 模拟物及相应阴性对照稀释于250 μL无血清培养基中，5 μL的Lipofectamine 2000稀释于250 μL无血清培养基中，室温静置5 min；将稀释的miR-21 抑制剂或miR-21 模拟物及相应阴性对照与稀释的Lipofectamine 2000混合，室温静置20 min；6孔板换液每孔加入1.5 mL完全培养基，将转染混合物缓慢加入6孔板，培养6 h后更换10% RPMI 1640完全培养基，继续培养。
1.6 Annexin V／PI染色检测细胞凋亡取对数生长期细胞胰酶消化后，离心收集细胞，4 ℃预冷PBS洗涤细胞2次，弃上清液；按凋亡试剂盒说明书进行操作，轻轻混匀，避光孵育20 min；流式细胞仪检测细胞凋亡，结果采用ModFitLTV 3.0软件进行细胞凋亡率分析。每组实验重复3次。
1.7 PI染色检测细胞周期分布取对数生长期细胞胰酶消化，离心收集细胞，4 ℃预冷PBS洗涤细胞2次，弃上清液；加入4 ℃预冷的70%乙醇重悬细胞，4 ℃固定过夜；离心收集固定完全的细胞，弃去70%乙醇；4 ℃预冷的PBS洗涤细胞2次，弃上清液；加入500 μL 4 ℃预冷的PI染色液(5 mg PI+2 mg RNaseA+0.1 mL 1.0%Trition X-100+3.7 mg EDTA+10 mL PBS，棕色瓶4 ℃保存，工作浓度50 μg／mL)重悬细胞，避光染色30 min；流式细胞仪检测，结果采用ModFitLTV 3.0软件进行各周期细胞的百分比分析。每组实验重复3次。
1.8 实时PCR检测耐药、凋亡相关基因mRNA及miR-21的表达Trizol法提取总RNA，根据操作说明书进行逆转录反应，分别以荧光定量PCR试剂盒或一步法miRNA 定量逆转录PCR试剂盒说明书进行耐药和凋亡相关基因及miR-21实时PCR检测，GAPDH和snRNA U6 作为内参，引物序列见表 1。相对表达量计算公式为：RQ=2-ΔΔCT，其中耐药和凋亡相关基因表达的ΔΔCT=CT值(实验组目的基因-实验组GAPDH)-CT值(对照组目的基因-对照组GAPDH)； miR-21表达的ΔΔCT=CT值(实验组miRNA-实验组U6 RNA)-CT值(对照组miRNA-对照组U6 RNA)。
| 基因名称 | 引物序列(5′-3′) | 片段长度 (bp) |
| MRP1 | 上游引物: ACTTCCTCTATCTCTCCCGACA | 246 |
| 下游引物: AAGACTGAACTCCCTTCCTCCT | ||
| BCRP | 上游引物: CTCAGTTTATCCGTGGTGTGTC | 176 |
| 下游引物: GATTGTTCGTCCCTGCTTAGAC | ||
| MDR1 | 上游引物: GTACCCATCATTGCAATAGC | 157 |
| 下游引物: CAAACTTCTGCTCCTGAGTC | ||
| Bcl-2 | 上游引物: ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA | 136 |
| 下游引物: ACAGTTCCACAAAGGCATCC | ||
| Bax | 上游引物: GGGGACGAACTGGACAGTAA | 122 |
| 下游引物: CAGTTGAAGTTGCCGTCAGA | ||
| GAPDH | 上游引物: CAGCCTCAAGATCATCAGCA | 106 |
| 下游引物: TGTGGTCATGAGTCCTTCCA |
胰酶消化对数生长期细胞，加入蛋白裂解液，充分吹打混匀，冰上放置30 min，4 ℃离心取上清液；采用蛋白质二喹啉甲酸法(BCA法)进行蛋白定量分析；10%十二烷基硫酸钠聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)，蛋白样品上样量为20 μg，蛋白标记物上样量为5 μL；电泳结束后转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭3 h，孵育一抗：分别加入鼠抗人P-gp、Bcl-2、Bax、和β-actin抗体4 ℃共同孵育过夜(工作浓度为1∶1000)，TBST缓冲液洗膜3次，每次10 min，HRP标记的兔抗鼠IgG(1∶5000)37 ℃孵育2 h后，PVDF膜化学发光显影，BIO-RAD成像系统拍照，AlphaView SA凝胶成像分析软件灰度扫描，定量分析各蛋白含量。
1.10 统计学方法所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行处理，计量资料以均数±标准差(±s)表示，呈正态分布数据均数间差异用t检验，多组样本均数之间差异采用方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 人乳腺癌细胞MCF-7和SKBR-3形态学观察光镜下，MCF-7和SKBR-3细胞贴壁生长，细胞生长均匀，边缘清晰，MCF-7细胞呈多边形，SKBR-3细胞呈梭形。而MCF-7／PR和SKBR-3／PR细胞胞质空泡形成、颗粒增多，细胞伸出许多不规则树突状分支，呈蜘蛛状或星状。见图 1。
|
| MCF-7细胞呈多边形，SKBR-3细胞呈梭形，MCF-7/PR和SKBR-3/PR细胞呈蜘蛛状或星状.标尺=50 μm. 图 1 人乳腺癌细胞MCF-7和SKBR-3亲本和紫杉醇耐药细胞形态学观察 Fig.1 Optical morphology of MCF-7 and SKBR-3 parental and paclitaxel resistant cells |
采用MTT法测定紫杉醇对MCF-7和SKBR-3细胞的生长抑制率，以紫杉醇药物浓度的对数值为横坐标，以细胞生长抑制率为纵坐标绘制剂量—抑制率曲线。经测定，紫杉醇作用72 h后MCF-7细胞IC50为(5.64±0.15)μmol／L，SKBR-3细胞IC50为(4.61±2.17)μmol／L。见图 2。
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| 图 2 紫杉醇对乳腺癌细胞MCF-7和SKBR-3的生长抑制曲线 Fig.2 The growth inhibition curve of MCF-7 and SKBR-3 cells treated with paclitaxel |
与MCF-7和SKBR-3细胞比较，MCF-7／PR、SKBR-3／PR细胞株中MDR1、BCRP、MRP1和Bcl-2 mRNA表达均上调，Bcl-2／Bax比值升高，miR-21表达上调(均P<0.05)，见图 3。提示人乳腺癌细胞MCF-7和SKBR-3经紫杉醇诱导后多药耐药相关基因表达增加，说明紫杉醇耐药细胞模型诱导成功，miR-21在耐药细胞株中表达增加。
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| 与相应亲本细胞比较，*P<0.05． 图 3 MCF-7、SKBR-3亲本和紫杉醇耐药细胞株中多药耐药相关基因、Bcl-2、Bax mRNA和miR-21的表达水平比较 Fig.3 Expression of multidrug resistance related gene，Bcl-2，Bax mRNA and miR-21 in MCF-7 and SKBR-3 parental and paclitaxel resistant cells |
与MCF-7、SKBR-3细胞株比较，MCF-7／PR、SKBR-3／PR细胞P-gp和Bcl-2蛋白表达升高，Bax蛋白表达降低(均P<0.05)，见图 4。结果提示紫杉醇耐药细胞MCF-7／PR、SKBR-3／PR多药耐药基因编码产物P-gp和抗凋亡基因Bcl-2蛋白表达增强。
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| 图 4 MCF-7 和 SKBR-3亲本及紫杉醇耐药细胞P-gp、Bcl-2和Bax蛋白表达 Fig.4 P-gp，Bcl-2 and Bax protein expression in MCF-7 and SKBR-3 parental and paclitaxel resistant cells |
miR-21 模拟物作用于MCF-7和SKBR-3细胞72 h后，光镜下可见MCF-7细胞株由多边形伸出不规则分支，细胞形态延长，黏附下降；SKBR-3细胞由正常的梭形变得更为细长，伸出很长的树突状分支，细胞整体呈蜘蛛状或星状，表现耐药细胞的形态，见图 5。
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| 加入miR-21模拟物后，MCF-7细胞伸出不规则分支，细胞形态延长，SKBR-3细胞变细长，呈蜘蛛状或星状.标尺=50 μm. 图 5 miR-21 模拟物对MCF-7和SKBR-3细胞形态的影响 Fig.5 The effects of miR-21 mimic on MCF-7 and SKBR-3 cells morphology |
分析转染miR-21 抑制剂后耐药细胞增殖情况。相对于空白对照组，阴性对照组耐药细胞的增殖抑制不明显，而miR-21抑制剂组在不同紫杉醇浓度作用下耐药细胞的增殖明显抑制，见图 6。提示抑制miR-21表达可提高乳腺癌耐药细胞对紫杉醇的敏感性。
|
| 图 6 miR-21抑制剂对MCF-7／PR和SKBR-3／PR细胞在不同浓度紫杉醇作用下生长抑制的影响 Fig.6 Drug susceptibility of MCF-7／PR and SKBR-3／PR cells treated with paclitaxol after transfected miR-21 inhibitor |
与空白对照组和阴性对照组比较，miR-21 抑制剂组MCF-7／PR、SKBR-3／PR细胞的凋亡均增加(均P<0.05)。表明miR-21 抑制剂能促进MCF-7／PR、SKBR-3／PR细胞凋亡。见表 2。
| (x±s，%) | ||
| 组 别 | MCF-7／PR | SKBR-3／PR |
| 空白对照组 | 3.863±0.1387 | 4.547±0.2267 |
| 阴性对照组 | 3.667±0.1532 | 4.760±0.2050 |
| miR-21 抑制剂组 | 13.44±0.3327*# | 17.34±0.2454*# |
| 与空白对照组比较，*P<0.05；与阴性对照组比较，# P<0.05. | ||
与阴性对照组比较，miR-21 抑制剂组MCF-7／PR、SKBR-3／PR细胞G0／G1期比例升高，S期和G2期比例降低(P<0.05)。提示miR-21抑制剂导致MCF-7／PR、SKBR-3／PR细胞G0／G1期阻滞，见表 3。
| (x±s，%) | ||||||
| 组 别 | MCF-7／PR | SKBR-3／PR | ||||
| G0／G1 期 | S 期 | G2／M期 | G0／G1 期 | S 期 | G2／M期 | |
| 阴性对照组 | 45.17±1.07 | 32.27±1.13 | 14.70±0.62 | 48.27±1.11 | 33.47±1.26 | 12.10±0.68 |
| miR-21抑制剂组 | 58.77±1.24 | 26.83±0.90 | 8.633±0.61 | 70.00±1.16 | 21.57±0.99 | 5.667±0.97 |
| P值 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 | <0.05 |
与空白对照组及阴性对照组比较，miR-21 抑制剂组miR-21表达下调，见图 7，耐药相关基因MDR1、凋亡相关基因Bcl-2表达下调，Bax表达上调(均P<0.05)，见图 8、9；miR-21模拟物组耐药相关基因MDR1、凋亡相关基因Bcl-2表达上调， Bax表达下调(均P<0.05)，见图 8、9。提示抑制miR-21表达可逆转MCF-7／PR、SKBR-3／PR细胞对紫杉醇的耐药性，促进细胞凋亡。
|
| 与另两组比较，*P<0.05. 图 7 miR-21 抑制剂对MCF-7／PR 和 SKBR-3／PR细胞miR-21表达的影响 Fig.7 Expression of miR-21 in MCF-7／PR and SKBR-3／PR cells after transfected miR-21 inhibitor |
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| 与另两组比较，*P<0.05. 图 8 miR-21对MCF-7、SKBR-3亲本和紫杉醇耐药细胞MDR1 mRNA表达的影响 Fig.8 Expression of MDR1 mRNA in MCF-7 and SKBR-3 parental and paclitaxel resistant cells after transfected miR-21 inhibitor |
|
| 与另两组比较，*P<0.05. 图 9 miR-21对MCF-7、SKBR-3亲本和耐药细胞Bcl-2、Bax mRNA表达的影响 Fig.9 Expression of Bcl-2 and Bax mRNA in MCF-7 and SKBR-3 parental and paclitaxel resistant cells after transfected miR-21 mimic or inhibitor |
与空白对照和阴性对照比较，miR-21 抑制剂下调耐药相关蛋白P-gp和凋亡相关蛋白Bcl-2表达，而上调Bax蛋白表达(均P<0.05)。miR-21 模拟物上调耐药相关蛋白P-gp和凋亡相关蛋白Bcl-2表达，而下调Bax蛋白表达(均P<0.05)，见图 10。提示抑制miR-21表达，可逆转细胞耐药性，促进凋亡。
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| 图 10 miR-21模拟物及抑制剂对MCF-7、SKBR-3亲本和紫杉醇耐药细胞P-gp、Bcl-2、Bax蛋白表达的影响 Fig.10 The expression of P-gp,Bcl-2 and Bax protein in MCF-7，SKBR-3 parental and paclitaxel resistant cells by miR-21 mimic or inhibitor |
紫杉醇是一种植物类抗肿瘤药物，对乳腺癌初治有效率达32%～60%，多药耐药是肿瘤化疗失败最常见的原因，耐药性产生与ATP结合盒蛋白家族(ABC)的药物转运载体过表达相关，包括MDR1及其编码产物P-gp、MRP和BCRP[5]。miRNA是一类大小在21～23个核苷酸的内源性的非编码RNA[6]，通过下调靶基因的表达或翻译而参与调节细胞的增殖、分化和凋亡[7, 8]。miRNA的特异性表达与特定肿瘤密切相关[9, 10, 11]。多项研究表明，miRNA参与乳腺癌紫杉醇耐药过程，如miR-221可作为乳腺癌患者接受过新辅助化疗后产生化疗耐药的生物标志物[12]，miRNA-200c的下调与乳腺癌耐药相关[13]，说明miRNA的表达异常可能与乳腺癌耐药性的获得有着极其密切的联系。
miR-21位于17p23.2染色体区域的脆性位点FRA17B，通过调控其靶基因，影响细胞的分化、增殖和凋亡。近几年，有研究者发现miR-21影响肿瘤耐药性。例如，Li等[14] 发现miR-21反义寡核苷酸可以抑制白血病HL-60细胞的活力，增加细胞的凋亡。并且miR-21反义寡核苷酸可以增加HL-60细胞对阿糖胞苷诱导凋亡的敏感性。Wang等[15]发现miR-21抑制剂联合细胞毒性药物地塞米松或阿霉素对骨髓瘤细胞的杀伤力比单独使用细胞毒性药物的作用明显。在对非小细胞肺癌进行研究时，抑制miR-21的表达能增强肺癌耐顺铂(DDP)细胞A549／DDP对DDP的药物敏感性，而过表达miR-21可导致A549细胞对化疗药物耐药的发生[16]。Tominaru等[17]对肝癌细胞转染miR-21抑制剂能够增加肝癌细胞对α干扰素／5-氟尿嘧啶的敏感性。然而，miR-21对乳腺癌在临床常用药物紫杉醇耐药中的作用报道较少。
本研究主要探讨miR-21在人乳腺癌细胞紫杉醇耐药中的角色，为临床逆转耐药、辅助化疗提供依据。首先，采用低浓度加量持续诱导法建立人乳腺癌细胞紫杉醇耐药株MCF-7／PR和SKBR-3／PR，并通过观察细胞形态、耐药指标及生物学活性进行鉴定。相对于亲本细胞，紫杉醇耐药细胞呈现蜘蛛状或星状生长，耐药基因MDR1及其编码蛋白P-gp、BCRP、MRP1表达均上调，表明耐药细胞建模成功。miR-21在耐药细胞株中表达上调。
为进一步明确miR-21在MCF-7和SKBR-3细胞紫杉醇耐药中的作用，以miR-21抑制剂抑制miR-21的表达。结果显示转染miR-21抑制剂后，相对于空白对照组和阴性对照组，MCF-7／PR和SKBR-3／PR细胞中miR-21表达下调，MDR1及其编码蛋白P-gp也下调。反之，miR-21 模拟物可刺激MCF-7和SKBR-3亲本细胞发生耐药细胞的形态改变，出现不规则分支，上调MDR1及其编码蛋白P-gp的表达。P-gp过表达是多药耐药主要原因。P-gp具有凋亡抑制作用，为肿瘤耐药与凋亡耐受之间在分子水平上建立了有机的联系。P-gp可延迟凋亡级联反应，保护耐药细胞免于自由基、放射线及细胞毒性药物等诱导的多种形式caspase依赖型凋亡[18]。实验证明与肿瘤相关的miR-21调控的靶基因可能包括原肌球蛋白基因1、程序性细胞死亡因子4、p53介导通路的基因，转化生长因子通路、磷酸酶基因(PTEN)等。miR-21能够通过与PTEN 3′非编码区序列的特异性结合，从而调控PTEN蛋白的表达水平[19] 。PTEN基因能够编码具有双特异性磷酸酶活性的蛋白，可以调控PI3K／Akt信号转导通路，从而调控Bcl-2和Bax的表达水平，实现对胃癌耐药的逆转[20] 。为探究miR-21调控乳腺癌耐药细胞凋亡机制，本研究比较了亲本细胞与耐药细胞中Bcl-2／Bax比值的变化。MCF-7／PR和SKBR-3／PR细胞相对于亲本细胞，Bcl-2／Bax比值升高。miR-21抑制剂可下调Bcl-2／Bax比值。反之，miR-21模拟物上调Bcl-2／Bax比值。可见Bcl-2和Bax虽不是miR-21的直接靶基因，但它们可能通过其他因子，间接被miR-21调控。
同时，miR-21的下调增加细胞凋亡能力，G0／G1期细胞比例增加说明miR-21抑制剂可通过促进细胞凋亡、调控细胞周期而抑制细胞增殖。因此，MCF-7／PR和SKBR-3／PR对紫杉醇产生的耐药性可能与miR-21高表达有关，抑制miR-21的表达可能会逆转紫杉醇耐药，提高药物敏感性。
综上所述，本研究通过对人乳腺癌MCF-7／PR、SKBR-3／PR耐药细胞转染miR-21抑制剂，对亲本细胞转染miR-21模拟物，发现miR-21可能通过调控Bcl-2和Bax影响细胞的增殖、凋亡，进而参与了乳腺癌细胞对紫杉醇的耐药。因此miR-21可能是潜在的逆转乳腺癌紫杉醇化疗耐药的新靶点，极具开发和应用价值。
志谢 感谢《浙江大学学报(医学版)》编辑部陈韶华副主任医师在本文修改过程中给予的悉心指导和热忱帮助.
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