癫痫(epilepsy)是一种常见的慢性中枢神经系统疾病，以反复不自主发作为主要临床表现。颞叶癫痫是最常见的难治性癫痫类型，其中以海马、海马旁回及杏仁核为病灶的正中颞叶癫痫患者中约75%最终会发展为难治性癫痫，这类患者无法通过服用抗癫痫药物控制其发作。少部分难治性癫痫患者可以通过手术切除病灶以缓解症状，但多数患者由于灶点不明确、多灶点或灶点在重要功能区等原因而无法手术^[1]。同时，手术治疗还容易损伤正常脑组织而引起较多的并发症等。反复的颞叶癫痫发作不但影响患者日常生活，而且极易引起患者认知功能损伤和意外死亡。因此，迫切需要寻找其他能有效干预颞叶癫痫发作的治疗策略。

深部脑刺激是癫痫治疗的新手段，其通过脑立体定位植入刺激电极，利用电刺激的方式干预脑内特定神经环路兴奋性从而达到疾病治疗的目的。与手术治疗相比其具有可逆性、可调性、微创性等优点^[2]。依据刺激频率的不同，深部脑刺激可分为低频率电刺激(1～3 Hz)和高频率电刺激(>5 Hz，常用50～150 Hz)^[3]。临床和动物实验研究表明高频率电刺激和低频率电刺激癫痫病灶等特定脑靶区均可有效抑制癫痫发作。其中高频率电刺激容易引起靶点损伤^[4]及可能诱发新的癫痫灶点^[5]；低频率电刺激具有对刺激靶点损伤小、电池能耗少和几乎没有点燃效应等优点^{[6, 7]}。我们前期研究首次发现低频率电刺激灶点外核团(如梨状皮层^[8]、海马下托^[9]和小脑^[10]等)能有效抑制大鼠杏仁核点燃癫痫的形成过程和大发作，并且优化低频率电刺激时间参数可获得更好的癫痫治疗作用^[11]。因此，低频率电刺激是极具前景的临床癫痫治疗策略。

由于作用机制和最佳刺激方案尚不清楚，以往研究主要集中在低频率电刺激靶点、频率及时间参数等的优化。即使采用相似的刺激靶点、频率等条件，依然还有很多相互矛盾的研究结果 ^{[12, 13, 14, 15]}。最近，我们的研究首次发现和证实低频率电刺激治疗癫痫存在“极性依赖性”现象^[16]，刺激电极的正极电流发挥重要的抗癫痫作用，该结果部分解释了上述矛盾的结果。由于电极的极性与刺激脉冲的波形密切相关，提示通过优化刺激脉冲的波形可能有助于提高低频率电刺激的抗癫痫作用。因此，本研究旨在研究电脉冲波形对低频率电刺激抗癫痫作用的影响，期望寻求更高效的低频率电刺激方案。

清洁级Ⅱ级7～8周龄的雄性C57BL/6小鼠由浙江省医学科学院实验动物中心提供，体质量22～35 g。所有动物单笼饲养于恒温的12 h昼夜交替(光照时间为上午8时～下午8时)环境中，自由摄取食物和水。实验遵从浙江大学实验动物中心的动物伦理规定以及美国国立卫生研究院关于《实验动物照护和使用》条例。动物行为学实验时间在每天上午10时到下午5时之间进行。

小鼠给予腹腔注射40 mg/kg戊巴比妥，麻醉后固定于立体定位仪(Narishige，SR-5，日本)。参照小鼠脑图谱坐标^[17]并以颅骨前囟为参照，在右侧海马体(AP:-2.9 mm，-3.0 mm，-3.0 mm)立体定位垂直植入电极。所用电极为三股螺旋不锈钢电极^[16]，电极丝(A.M.Systems.Inc，美国)为Teflon绝缘，直径为0.2 mm，末端剥去绝缘层0.5 mm。电极植入后外端与微型插座焊接并用牙科水泥固定于颅骨上。

小鼠植入电极休息1周后，使用隔离刺激器(Stimulation Isolator，AD instruments，美国)测定小鼠的后放电阈值(afterdischarge threshold，ADT)，使用脑电记录仪(Synamps RT，Neuroscan System，美国)放大并记录海马内脑电图，测定后放电持续时间(afterdischarge duration)。隔离刺激器刺激参数为1 ms波宽的单相方波，频率20 Hz，时长2 s，电流从40 μA 开始，间隔1 min增加20 μA，当脑电图记录到至少持续5 s后放电持续时间的电流强度为ADT。如小鼠ADT小于200 μA，则用于海马快速点燃造模。海马快速点燃过程中采用400 μA电流刺激，刺激参数为单相方波，20 Hz，波宽为1 ms，刺激持续时间为2 s，每天刺激10次，每次间隔30 min。建模3～4 d后，小鼠处于完全点燃状态，提示造模成功。

癫痫发作行为学等级采用 Racine 评分方法^[18]。1级：面部抽动，咀嚼明显；2级：点头；3级：单侧前肢阵挛抬起；4级：双侧前肢阵挛和站立；5级：双侧前肢阵挛，站立以及失去平衡跌倒。此外，还记录了后放电持续时间和大发作持续时间(generalized seizures duration)即双侧前肢阵挛的持续时间。当动物连续3次癫痫行为学发作5级，则认为已经完全点燃。癫痫大发作概率(%)=小鼠癫痫行为学发作等级为4或5级的发作次数总和/小鼠癫痫行为学发作的总次数×100%。

为比较不同脉冲波形低频率电刺激的抗癫痫作用，将完全点燃的动物分为4组，对照组只给予电点燃刺激；其他各组在电点燃刺激结束之后立即给予时长30 s、频率1 Hz、波宽1 ms、强度3 V的低频率电刺激干预，根据输出波形不同分为正弦波组、单相方波组、双相方波组。三者除波形外其余参数均相同。

为比较30 s正弦波与常规15 min单相方波低频率电刺激的抗癫痫作用，将完全点燃的动物分成3组，对照组只给予电点燃刺激；30 s正弦波组在电点燃刺激结束之后立即给予时长30 s正弦波低频率电刺激；15 min单相方波组在电点燃刺激结束之后立即给予时长15 min单相方波低频率电刺激。

为比较正弦波低频率电刺激的“时间窗”效应，将完全点燃的动物分为4组，对照组只给予电点燃刺激；其余3组分别在电点燃刺激前30 s、点燃刺激后3 s和10 s给予持续30 s正弦波低频率电刺激。

采用SPSS 16.0 统计软件进行分析，全部数据以均数±标准误(x± s)表示。大发作概率的比较用χ²检验。等级数据统计先采用Kruskal-Wallis检验进行多组间分析，之后采用非参数Mann-Whitney U检验比较各组间差异。计量资料采用单因素方差分析，组间比较采用Tukey检验。P<0.05为差异有统计学意义。

对照组稳定出现癫痫大发作。与对照组比较，正弦波组癫痫大发作概率、后放电持续时间和大发作持续时间减少，癫痫发作等级降低；双相方波组、单相方波组上述癫痫发作情况与对照组比较差异无统计学意义，见表 1和图 1。提示正弦波低频率电刺激可以减少小鼠癫痫的发作。

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01. 图 1 不同脉冲波形低频率电刺激对小鼠癫痫的作用比较 Fig. 1 The effects of different waveforms of low-frequency stimulation on seizure

图选项

在小鼠海马电点燃之后立即给予15 min单相方波或者30 s正弦波低频率电刺激都有较好的抗癫痫效果。与对照组比较，15 min单相方波组癫痫大发作概率减少和发作等级降低。与15 min单相方波组比较，30 s正弦波组的后放电持续时间、大发作持续时间缩短；而发作等级和大发作概率差异无统计学意义，见表 2和图 2。提示30 s正弦波低频率电刺激的抗癫痫效果较15 min单相方波低频率电刺激更明显。

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与正弦波30 s组比较，#P<0.05 ，##P<0.01． 图 2 正弦波低频率电刺激 30 s与单相方波低频率电刺激 15 min影响小鼠癫痫发作的比较 Fig. 2 The effects of 30 s sine wave and 15 min monophase square low-frequency stimulation on seizure

图选项

在不同时间点给予正弦波的低频率电刺激，结果发现电点燃刺激之前给予可以减少癫痫的发作概率、后放电持续时间和大发作持续时间，降低癫痫发作等级；在电点燃结束之后3 s给予正弦波低频率电刺激也有上述作用。而电点燃之后10 s给予则没有上述抗癫痫效果。见表 3和图 3。提示电点燃刺激之前或其后3 s给予正弦波低频率电刺激可以抑制癫痫的发作。

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01 图 3 不同时间点给予正弦波低频率电刺激影响小鼠癫痫发作比较 Fig. 3 The effects of sine wave low-frequency stimulation delivered at different time points on seizure．

图选项

海马癫痫是最常见的颞叶癫痫类型，极易对抗癫痫药物耐受^[19]。本研究采用海马电点燃癫痫小鼠模型，发现刺激波形会明显影响灶点低频率电刺激的抗癫痫作用。其中正弦波低频率电刺激具有较强的抗癫痫作用，其作用强于目前常用的15 min方波低频率电刺激，可能作为临床颞叶癫痫低频率电刺激治疗的新策略。

低频率电刺激作为临床颞叶癫痫治疗的潜在新方法，以往的研究者主要采用长时间(如每次刺激时间≥15 min)连续的低频率电刺激。本研究发现在小鼠海马电点燃癫痫模型中15 min方波低频率电刺激能有效抑制癫痫大发作，与先前在大鼠杏仁核电点燃癫痫研究一致 ^{[20, 21, 22, 23]}，但过短的方波低频率电刺激(30 s)没有明显抗癫痫作用。有趣的是，本研究发现30 s的正弦波低频率电刺激可以明显抑制癫痫大发作，其对后放电持续时间的抑制作用甚至较15 min的普通方波低频率电刺激更强。而研究中所采用的30 s正弦波与方波刺激的波宽、最大刺激强度、时程、频率、刺激靶点及给予方式均完全一致，不同的仅是两者的波形参数。因此，虽然没有更多数据解释为何波形差异会导致如此明显的抗癫痫作用差别，但研究结果直接提示刺激波形可能是低频率电刺激抗癫痫作用的关键因素，正弦波可能是较优的波形参数。以往也有少量研究采用正弦波刺激，这些研究者大多采用刺激时长15 min，然而长时间的低频率电刺激可能导致更多不良反应^{[24, 25]}。最近，Goodman等^[26]发现杏仁核点燃刺激前预先给予30 s正弦波刺激具有明显抗癫痫作用。但是癫痫发作较难预测，所以预先给予这种刺激模式不易实现，相对而言本研究中采用的发作后给予方式更易实现。因此，结合上述研究结果，提示最佳的低频率电刺激波形可能需要根据不同刺激靶区或癫痫类型进一步优化。

另一方面，先前研究已经发现，癫痫发作后何时给予低频率电刺激对其抗癫痫作用非常重要。最近，我们研究发现只有在电点燃刺激结束较短的时间内给予方波低频率电刺激才能干预癫痫发作^[11]，而且在海马预先给予方波低频率电刺激抗癫痫作用弱于癫痫发作后给予低频率电刺激^[27]。因此，本研究中，我们也进一步考察了正弦波低频率电刺激的时间窗特征。我们发现电点燃刺激结束后3 s内给予正弦波低频率电刺激具有抗癫痫作用，但是电点燃刺激结束后10 s再给予低频率电刺激其抗癫痫作用减弱，提示正弦波低频率电刺激的抗癫痫作用同样具有时间窗现象。而预先给予或发作后给予正弦波具有相似的抗癫痫作用，提示正弦波可能较方波低频率电刺激具有相对更宽的时间窗。最近，依据患者脑电信号给予反馈性闭环刺激的临床设备已经通过了美国食品药品监督管理局的审批用于耐药癫痫患者，并且通过很多算法的改进可能准确预测癫痫发作。此外，我们最近研究发现单相方波刺激可能存在极性依赖性效应进而影响低频率电刺激抗癫痫作用^[16]。正弦波是对称波形，因而其不存在极性依赖性效应，方便临床低频率电刺激的应用。综合上述，我们的结果提示正弦波低频率电刺激可能是临床闭环深部脑刺激治疗癫痫的潜在选择。

低频率电刺激的抗癫痫作用机制较为复杂，目前还不清楚。研究表明正弦波刺激与方波刺激下神经元的反应性有所差别。经颅正弦波电刺激对皮层或海马的神经元单位放电主要为跟随的节律性调节^{[28, 29]}，而方波刺激往往表现为对负极靶区的神经元放电发挥兴奋作用和对正极靶区的神经元放电发挥抑制作用。因此，本研究中正弦波与方波的作用差别可能与两者神经元放电调控效能或特征有关。另一方面，多通道微电极记录表明癫痫发作是一个复杂神经网络放电过程^[30]，而最近光遗传学研究发现失活灶点的兴奋性神经元只有在癫痫起始阶段才能有效干预癫痫发作^[31]。因此，灶点低频率电刺激也可能通过影响癫痫起始阶段的局灶的神经放电活动而发挥作用的，一旦癫痫放电扩散至灶点外的神经网络，这种灶点的低频率电刺激可能就失去了原有的癫痫干预作用。

总之，我们的研究发现波形是低频率电刺激发挥抗癫痫作用的关键因素，正弦波优化后的低频率电刺激可以通过短时间刺激达到与普通方波低频率电刺激相似或更强的抗癫痫作用，并且刺激起始的时机对于正弦波低频率电刺激较为重要。正弦波低频率电刺激可能是临床闭环刺激干预癫痫发作的潜在手段。