2. 上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心, 上海 201203
2. Shi's Center of Orthopedics and Traumatology, Shuguang Hospital Affiliated to Shanghai TCM University, Shanghai 201203, China
正常的软骨结构是由细胞外基质如Ⅱ型胶原和蛋白多聚糖 (Aggrecan为主)组成。为维持软骨结构完整，基质成分通过基质降解酶如基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)13和含血小板结合蛋白基序的解聚蛋白样金属蛋白酶5(A disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 5，ADAMTS5)不断进行更新和重塑，基质的降解和合成同时进行，从而维持软骨结构的完整 [1, 2, 3, 4]。当软骨组织中这种合成和降解失衡时，软骨细胞发生退变和炎症。
白细胞介素(interleukin，IL)1β是导致关节软骨破坏最主要的细胞因子，IL-1β激活降解酶MMP-13促进Ⅱ型胶原和蛋白多聚糖的降解[5]。但由于体内环境复杂，关节软骨的退变是多因子多因素协同作用的结果，IL-1β作为软骨细胞退变模型的单一诱导因子存在其局限性，尤其在筛选一些骨关节炎治疗的药物方面。已有研究表明在含有血清的培养基中培养软骨细胞，软骨细胞将逐渐失去原有的细胞形态，软骨标志性基因表达下调，软骨发生退变；采用血清替代物培养软骨后，将有效抑制软骨的退变[6, 7, 8]。这些研究提示刺激软骨退变的物质可能来源于血液中的某些成分。本文模拟体内软骨的情况，采用大鼠血清培养新生大鼠原代软骨细胞，用经典的炎性因子IL-1β作为诱导软骨退变的阳性对照，分别从软骨细胞形态变化、生长增殖和基因表达变化方面进行观察和比较，证实应用血清可建立大鼠体外研究骨关节炎的细胞模型。
1 材料与方法 1.1 动物、试剂及主要仪器新生SD大鼠8只和4月龄SD大鼠4只购自上海西普尔—必凯实验动物有限公司，动物合格证号:SCXK(沪2008-0016)。
高糖DMEM 培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素—链霉素混合溶液、磷酸盐缓冲液片剂均购自法国Biowest公司；PVDF膜购于美国Millipore公司；Ⅱ型胶原酶购自美国Sigma公司；MMP-13抗体、3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体、山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)标记二抗和山羊抗小鼠HRP标记二抗均购自美国CST公司；增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)抗体购自美国Santa Cruz公司，BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司； Trizol购自美国Invitrogen公司；AMV逆转录酶购自日本Takara公司。主要仪器：170-200P二氧化碳培养箱(英国RS Biotech公司)、IX-71倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)、SYNERGY2多功能酶标仪(美国基因公司)。
1.2 大鼠血清制备4月龄SD大鼠，每100 g体质量腹腔内注射0.15 mL的3%戊巴比妥钠(给药剂量为45 mg/kg)，深度麻醉后沿腹部正中线打开腹腔，暴露腹主动脉，用10 mL的一次性注射器缓慢抽吸腹主动脉血，转移到15 mL一次性无菌离心管中室温静置2 h，3000×g离心20 min，吸取上层血清-80 ℃保存备用。见参考文献[9]。
1.3 软骨细胞培养和形态学观察采用本研究所已经成熟的软骨细胞培养方法[10]，将8只新生24 h SD大鼠颈椎脱臼法处死并用75%乙醇溶液浸泡5 min ，取出四肢关节处软骨，剔除残留的血管和结缔组织后用眼科剪剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的软骨块，放入0.1%的Ⅱ型胶原酶中置于37 ℃培养箱中消化1 h，重复3～4次，收集消化的细胞悬液，1000×g离心10 min后弃胶原酶，用含10%胎牛血清、青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基重悬细胞，接种于培养皿，隔日换液。3～4 d后，待细胞铺满皿底，用胰酶消化传代培养，取原代细胞进行实验。倒置显微镜下观察各组软骨细胞的密度与形态。
1.4 MTT法检测细胞增殖情况将细胞用胰酶消化后，以5×103/孔接种于96孔培养板，分别于含10%胎牛血清的DMEM(对照组)、含50 ng/mL IL-1β+10%胎牛血清的DMEM(IL-1β组)、含2.5%大鼠血清的DMEM(2.5%血清组)及含5.0%大鼠血清的DMEM(5.0%血清组)中培养。培养24 h、48 h及72 h后，胎牛血清漂洗2遍，每孔加入100 μL无血清培养液及含5 g/L的MTT试剂20 μL，培养箱中培养4 h后，加入150 μL DMSO，室温振荡混匀10 min后，酶标仪490 nm波长下测定各孔吸光度值。细胞增殖率=(实验组吸光度值-对照组吸光度值)/ 对照组吸光度值×100%。细胞增殖率为正，表示促进细胞增殖；若为负值，表示抑制细胞增殖。
1.5 蛋白质印迹法检测蛋白表达原代细胞传代24 h后，分别置于含10%胎牛血清、50 ng/mL的IL-1β+10%胎牛血清、2.5%大鼠血清和5.0%大鼠血清的DMEM中培养。24 h后于裂解液中裂解细胞，提取蛋白并进行浓度测定，蛋白变性后备用。每组取40 μg总蛋白上样，分离胶和浓缩胶电泳时电压分别为90 V和120 V，电泳结束后进行转膜，恒流300 mA，时间为90 min。转膜后，PVDF膜于10%牛血清白蛋白中室温封闭1 h； Ⅱ型胶原酶、MMP-13、GAPDH和PCNA抗体用封闭液1∶1000稀释，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜4次，每次10 min；二抗用TBST 1∶20000稀释，室温孵育1 h，TBST洗膜4次，每次10 min；化学发光法检测，X胶片曝光显影。经Image J软件进行灰度测定及分析，最后进行数据统计。
1.6 实时定量PCR检测mRNA表达原代软骨细胞经过上述处理后继续培养24 h，抽提总RNA及浓度测定，取2 μg RNA逆转录成cDNA。进行实时定量PCR检测。Aggrecan、MMP-9、SOX (sex determining region Y related high mobility group box)-9、ADAMTS5和GAPDH引物设计和合成在上海英骏生物技术公司完成，具体引物序列见表 1。根据实时定量PCR的CT值结果，按照计算公式：F(倍数)=2-ΔΔCT，ΔΔCT=CT值(样品目的基因-样品GAPDH)-CT值(对照组目的基因-对照组GAPDH)，计算各组基因表达变化，并进行统计分析。
| 基因名称 | 引物序列 |
| Aggrecan | 上游引物：5′-GCAGGGATAACGGACTGAAG-3′下游引物：5′-GAGTAAAGTGGTCATAGTTCAGCTTG-3′ |
| MMP-9 | 上游引物：5′-CCTCTGCATGAAGACGACATAA-3′下游引物：5′-GGTCAGGTTTAGAGCCACGA-3′ |
| SOX-9 | 上游引物：5′-ATCTTCAAGGCGCTGCAA-3′下游引物：5′-CGGTGGACCCTGAGATTG-3′ |
| ADAMTS5 | 上游引物：5′-AGCCATCCTGTTCACCAGAG-3′下游引物：5′-CATTCCCAGGGTGTCACAT-3′ |
| GAPDH | 上游引物：5′-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3′下游引物：5′-CTCAGCACCAGCATCACC-3′ |
实验数据用SPSS 15.0软件进行统计分析，所有数据以均数±标准差(x± s)表示，组间差异采用单因素方差分析中LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果 2.1 大鼠血清对软骨细胞形态的影响培养24 h后，对照组细胞呈多角形、短梭形等形态，紧密排列成铺路石状；IL-1β组、2.5%血清组和5.0%血清组细胞密度较对照组细胞明显增加，且细胞形态逐渐细长，尤其是5.0%血清组的细胞形态改变尤为明显，见图 1。
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| A：对照组细胞为多角形； B：IL-1β组细胞相对于对照组变得细长；2.5%血清组(C)、5.0%血清组(D)上述细胞形态变化更明显.标尺=100 μm． 图 1 倒置显微镜下各组细胞形态观察 Fig. 1 Cell morphology under inverted microscope |
与对照组比较，IL-1β组、2.5%血清组和5.0%血清组软骨细胞培养1 d、2 d和3 d后细胞增殖率均显著增加，差异具有统计学意义(均P<0.05)；而且2.5%血清组和5.0%血清组软骨细胞增殖率均高于IL-1β组(均P<0.05)。见图 2。
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| 不同时间培养后，软骨细胞增殖率对照组为零，IL-1β组、2.5%血清组和5.0%血清组软骨细胞增殖率均比对照组增加，两血清组细胞增殖率也显著大于IL-1β组.与对照组相应培养时间比较，*P<0.05；与IL-1β组相应培养时间比较，#P<0.05． 图 2 各组软骨细胞增殖率比较 Fig. 2 The effect of rat serum and IL-1β on chondrocyte proliferation |
IL-1β组、2.5%血清组和5.0%血清组的PCNA表达均大于对照组，其中两血清组的PCNA表达量大于IL-1β组。与对照组比较，IL-1β组、2.5%血清组和5.0%血清组的Ⅱ型胶原表达下调；且两血清组的Ⅱ型胶原的下调比IL-1β组更显著。而IL-1β组、2.5%血清组和5.0%血清组MMP-13表达较对照组增加，且IL-1β组的MMP-13增加最明显(均P<0.05)。见图 3。
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| A：大鼠血清和IL-1β均增加PCNA的表达，尤其两血清组更明显；大鼠血清和IL-1β均增加Ⅱ型胶原的降解及MMP-13的表达，其中两血清组Ⅱ型胶原的降解更明显，而IL-1β组MMP-13表达增加更明显.B：各组PCNA、Ⅱ型胶原和MMP-13与GAPDH比值比较.与对照组比较，*P<0.05；与IL-1β组比较，#P<0.05． 图 3 蛋白质印迹法检测各组软骨细胞PCNA、Ⅱ型胶原和MMP-13蛋白表达及比较 Fig. 3 The effect of rat serum and IL-1β on protein expressions of PCNA,typeⅡ collagen and MMP-13 shown in Western blotting |
与对照组比较，IL-1β组和两血清组软骨细胞ADAMTS5和MMP-9 mRNA表达均增加，IL-1β组增加更明显，5.0%血清组软骨细胞ADAMTS5和MMP-9 mRNA表达大于2.5%血清组。与对照组比较，IL-1β组和两血清组软骨细胞Aggrecan和SOX-9 mRNA表达均减少，IL-1β组减少更明显(均P<0.05)；而5.0%血清组软骨细胞Aggrecan和SOX-9 mRNA表达均少于2.5%血清组(均P<0.05)。见图 4。
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| 大鼠血清和IL-1β均上调ADAMTS5和MMP-9的表达及下调Aggrecan和SOX-9的表达.与对照组比较，*P<0.05；与IL-1β组比较，#P<0.05． 图 4 各组软骨细胞ADAMTS5、MMP-9、Aggrecan和SOX-9 mRNA表达比较 Fig. 4 The effect of rat serum and IL-1β on mRNA expressions of ADAMTS5,MMP-9,Aggrecan and SOX-9 shown by real-time PCR |
关节软骨是无血管性组织，在骨关节炎中，最显著的特征即新生血管的发生。新生血管从软骨下骨越过潮线到达软骨层，刺激软骨细胞的退变、肥大和钙化[11]。通过阻断血管的生成可有效抑制骨关节炎的发生[12]。新生血管的侵入，可能通过释放血管中某些物质导致软骨细胞退变。
在骨关节炎的发病过程中，尤其在早期可见软骨下骨处血管异常增生，通过骨软骨连接处向软骨内侵入。本研究采用IL-1β和大鼠血清分别干预软骨细胞，在24 h后即可见软骨细胞形态发生显著改变，细胞由原来的多角形变成长梭形，而大鼠血清干预组的细胞变得更为细长，失去软骨细胞原有的形态特征。这与骨关节炎发生过程中关节软骨细胞的形态变化一致，即随着病变的程度加深，软骨细胞分别发生成纤维化和肥大化[13]。体外软骨培养中发现，血清将诱导软骨细胞发生肥大化改变，而在含有血清替代物和大量细胞因子的培养液可维持软骨细胞表型，进一步说明血清中相关成分可刺激软骨发生退变[14]。
在细胞增殖方面，本研究通过MTT法检测发现IL-1β和大鼠血清可促进软骨细胞增殖，同时IL-1β和两血清组软骨细胞PCNA的表达亦明显上调，这些研究结果与早期骨关节炎软骨细胞代谢显著增加的报道相吻合[15]。
关节软骨细胞外基质的丢失是导致退行性骨关节炎和其他炎性关节炎的共同特征[16, 17, 18]，关节软骨细胞基质主要由Ⅱ型胶原和蛋白多聚糖构成。因此判断软骨退变的关键在于Ⅱ型胶原和蛋白多聚糖的降解与否及调控基因的表达。
大鼠血清明显促进软骨细胞退变，在促软骨细胞退变的各项指标上，不同于IL-1β诱导的软骨退变，大鼠血清显著下调软骨细胞标志基因Ⅱ型胶原的表达，但对于诱导Ⅱ型胶原降解的基因MMP-13的上调表达作用弱于IL-1β的作用。除MMP-13对Ⅱ型胶原的调控作用，MMP-9也参与Ⅱ型胶原的调控，其表达也出现与MMP-13一致的改变。蛋白多聚糖在软骨细胞中起到支撑作用，其中以Aggrecan基因为代表，大鼠血清和IL-1β均明显下调Aggrecan的表达，但其效应弱于IL-1β的诱导作用。Aggrecan基因的表达受到ADAMTS5基因的调控作用，在本文的研究中，两血清组和IL-1β组的ADAMTS5表达均比对照组上调，5.0%大鼠血清组和IL-1β组的表达水平相当。SOX-9是软骨细胞中重要的转录因子，调控软骨细胞中蛋白多聚糖和Ⅱ型胶原的表达[19, 20]。而在增殖的软骨细胞中，SOX-9可保持细胞表型而抑制软骨细胞退变[21]。在两血清组和IL-1β组SOX-9的表达均下调。
在发生骨关节炎时，最早的病理改变即为新生血管的形成，由于血液中含有大量的细胞因子，如IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和抑瘤素 (oncostatin M)，这些均可导致骨关节炎的发生和发展[22]。故传统的IL-1β作为软骨退变的诱导剂用于关节病变机制研究和药物筛选存在其局限性。大鼠血清在改变软骨细胞形态、诱导软骨基质蛋白降解及上调基质降解酶表达方面具有与IL-1β相似的效应，但在调控这些基因和蛋白表达方面不同于IL-1β，进一步提示体内软骨退变相关机制复杂。本文利用大鼠血清建立软骨退变模型，比既往的利用单一因子如IL-1β和TNF-α等建立的细胞模型更为可靠，可进一步应用于病理机制和药物筛选的研究。
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