随着国内计划生育新政策的实施，有再生育需求的夫妇比例不断攀升。虽然他们都曾生育过，但是这些夫妇中很大一部分由于女方年龄偏大、输卵管阻塞、输卵管切除、曾接受多次人工流产宫腔操作或是由于男方精液质量下降等原因，再次自然怀孕并生育二胎的愿望不能顺利实现。按照WHO标准，既往有妊娠史、夫妻未避孕试孕1年未怀孕，即为“继发不孕”。部分再生育继发不孕妇女经医师评估和知情沟通后可选择体外受精—胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)技术助孕。再生育继发不孕妇女行IVF-ET治疗是否成功的影响因素较多，我们回顾性分析了来自单中心再生育继发不孕行IVF-ET治疗妇女不同临床妊娠结局的影响因素，以期为提高妇女再生育的助孕成功率提供临床决策方面的指导。

收集2012年7月至2014年7月所有在浙江大学医学院附属妇产科医院因继发不孕行IVF-ET治疗的再生育妇女的临床、实验室及随访资料。纳入标准：曾生育过(包括早产、足月产，无论子代是否仍存活)，正常性生活未避孕未孕1年以上行IVF-ET治疗且所移植的胚胎为新鲜胚胎而非冻融胚胎的妇女。收集的资料包括不育年限、避孕时间、男女双方年龄、女方体质量指数、月经初潮年龄、基础内分泌、窦卵泡数、丈夫是否酗酒吸烟、丈夫精液情况、不孕原因、胚胎培养天数、移植胚胎数及IVF-ET过程中的激素水平和实验室指标。纳入分析的共计来自1 099例妇女的1 129个IVF-ET治疗周期，女方平均年龄为(35.98±4.78)岁，男方平均年龄为(37.68±5.75)岁。

将1 129个IVF-ET治疗周期按是否临床妊娠分为两组：未临床妊娠者753例(66.70％)和临床妊娠者376例(33.30％)。通过单因素分析比较两组在男女双方年龄、体质量指数、不育年限、避孕时间、月经初潮年龄、是否吸烟和酗酒、月经第1～3天血基础卵泡刺激素、黄体生成素、雌二醇、窦卵泡数等各临床和实验室指标的差异。将单因素分析中差异有统计学意义的因素纳入二元logistic回归分析，得到再生育继发不孕妇女行IVF-ET临床妊娠结局的独立影响因素。

按年龄<30岁、30岁≤年龄<35岁、35≤年龄<40岁、年龄≥40岁分为4层，观察各年龄层妇女血基础卵泡刺激素、雌二醇、窦卵泡数等基础情况，以及注射人绒毛膜促性腺激素(HCG)日(当日清晨7时抽血检验)血雌二醇、取卵日内膜厚度、获卵数、减数分裂Ⅱ期卵数、受精卵数、获胚数、优质胚胎/可利用胚胎数等IVF-ET结局指标的差异，探讨年龄影响临床妊娠结局的可能原因及关键环节。

在上述年龄分层的基础上，每个年龄层又按照胚胎移植数(单胚胎、双胚胎、三胚胎)分为3亚组(因获胚数为0个而未能行胚胎移植的妇女未纳入，<30岁三胚胎亚组因例数太少归入双胚胎亚组)，分析各亚组的临床妊娠结局差异。本研究的单胚胎移植并非针对预后良好妇女的选择性单胚胎移植。本研究中移植单胚胎者对于年龄无限定，且包括多次行IVF-ET治疗失败、无优胚、只获1个胚胎等非选择性的所有移植入1个胚胎的妇女。

将年龄≥40岁妇女按其采用的目前临床较常用的3种控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation，COH)方案进一步分成三个亚组，即促性腺激素释放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)激动剂长方案组、GnRH激动剂短方案组和GnRH拮抗剂方案组(对于采用GnRH激动剂超长方案、单用人绝经期促性腺激素、微刺激方案、自然周期等方案的妇女，因各自例数较少，不列入分析)，观察每组的女方年龄、移植胚胎数、基础卵泡刺激素、促性腺激素总量、注射性腺激素天数、注射HCG日血雌二醇水平、获卵数、受精卵数、获胚数、优胚数、临床妊娠率等一系列指标，比较3种常用COH方案对于年龄≥40岁的高龄再生育不孕妇女的助孕效果。

临床妊娠的确定：胚胎移植术后14 d检测血β-HCG水平，阳性者于移植后30～35 d行超声检查，以可见妊娠囊且妊娠囊中存在胎芽和原始心管搏动确定为临床妊娠。

应用SPSS 22.0 统计学软件进行分析。连续变量用均数±标准差(x±s)表示，计量资料满足正态分布时行独立样本t检验或单因素方差分析，非正态分布数据采用非参数检验。率的比较用卡方检验。统计学显著性水平定为双侧检验。单因素分析结果有统计学意义的变量进入二元logistic回归模型，方法为向后法。 以P<0.05为差异有统计学意义。

将再生育继发不孕妇女行IVF-ET治疗结局按是否临床妊娠分为妊娠与未妊娠两组，进行其影响因素的单因素分析，结果发现，与未妊娠组比较，妊娠组男女双方年龄较小，女方体质量指数更低，基础卵泡刺激素更低，双侧窦卵泡数更多，移植胚胎数更多，差异均有统计学意义(均P<0.05)。但两组在女方不育年限、避孕时间、月经初潮年龄、血基础卵泡刺激素/基础黄体生成素、基础雌二醇、丈夫酗酒、丈夫吸烟、丈夫精液量及密度、胚胎培养天数、不孕病因构成上差异无统计学意义。见表 1。

将单因素分析结果有统计学意义的6个变量纳入二元logistic回归模型，分析结果见表 2。可以发现，女方年龄和移植胚胎数是IVF-ET治疗再生育继发不孕妇女不同临床妊娠结局的独立影响因素(P<0.05)，女性年龄增加是IVF-ET治疗再生育继发不孕妇女临床妊娠失败的独立危险因素，而胚胎移植数增加是临床妊娠成功的独立保护因素。女性体质量指数增加、基础卵泡刺激素水平升高、基础窦卵泡数减少有增加IVF-ET治疗再生育继发不孕妇女临床妊娠失败的趋势，但均不是独立影响因素。

本研究样本中，有临床妊娠并有活婴出生的女方年龄最大为45周岁(指开始IVF-ET治疗周期时年龄)，临床妊娠但无活婴出生的女方年龄最大为46周岁。进一步将年龄分4层，发现大年龄女性血基础卵泡刺激素水平较小年龄女性显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)。注射HCG日血雌二醇水平、获卵数、受精卵数、优胚数等在年龄<30岁组和30岁≤年龄<35岁组妇女差异无统计学意义，但其在女性年龄≥40岁组则显著低于35岁≤年龄<40岁组，差异有统计学意义(均P<0.05)。双侧窦卵泡数、取卵日子宫内膜厚度和临床妊娠率在年龄<40岁各组间差异无统计学意义(均P＞0.05)，但年龄≥40岁组与<40岁各组比较差异均有统计学意义(均P<0.05)。而各组间血基础雌二醇水平差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 3。

再生育继发不孕妇女年龄<30岁、30岁≤年龄<35岁、35岁≤年龄<40岁、≥40岁者临床妊娠率分别为42.27%(41/97)、40.38%(128/317)、37.27%(164/440)、15.64%(43/275)，差异有统计学意义(P<0.001)。≥40岁者临床妊娠率均低于<30岁、30岁≤年龄<35岁、35岁≤年龄<40岁者(均P<0.05)。

对不同年龄不同移植胚胎数妇女的临床妊娠结局分析结果见表 4。提示在30岁≤年龄<35岁和35≤年龄<40组中，双胚胎临床妊娠率均大于单胚胎，但与三胚胎组差异均无统计学意义(均P＞0.05)。年龄≥40岁组中，双胚胎移植组的临床妊娠率高于单胚胎，但低于三胚胎，差异均有统计学意义(均P<0.05)。若与<30岁多胚胎移植组比较，30岁≤年龄<35的双胚胎组、35≤年龄<40的双胚胎组与其差异均无统计学意义(P>0.05)，年龄≥40岁各亚组差异均有统计学意义(P<0.05)。

年龄≥40岁使用3种不同COH方案妇女的女方年龄、移植胚胎数差异无统计学意义(均P＞0.05)，GnRH激动剂长方案和GnRH激动剂短方案组血基础卵泡刺激素水平差异无统计学意义(P＞0.05)，但GnRH拮抗剂方案组血基础卵泡刺激素低于其他两组(均P<0.05)。与GnRH激动剂长方案组比较，GnRH激动剂短方案组妇女促性腺激素总量少，注射促性腺激素天数少，注射HCG日血黄体生成素水平高，获卵数、减数分裂Ⅱ期卵数、受精卵总数、获胚胎数、优胚数少(均P<0.05)。与GnRH拮抗剂方案组比较，GnRH激动剂短方案者注射HCG日血雌二醇和黄体生成素更高(P<0.05)。GnRH激动剂长方案者注射HCG日血雌二醇、获卵数、减数分裂Ⅱ期卵数、受精卵总数、获胚胎数、优胚数均高于GnRH拮抗剂组(均P<0.05)。见表 5。但3组的临床妊娠率分别为19.51%(8/41)、18.42％(21/114)和15.56%(7/45)，差异无统计学意义(P=0.878)。

我们的研究发现，虽然女方年龄、男方年龄、女方体质量指数、基础卵泡刺激素、双侧窦卵泡数、移植胚胎数都是再生育继发不孕行IVF-ET治疗后影响临床妊娠结局的因素，但只有女方年龄和胚胎移植数是其独立影响因素。30岁≤年龄<35岁组的基础卵泡刺激素高于年龄<30岁组，低于35岁≤年龄<40岁组，而35岁≤年龄<40岁组的基础卵泡刺激素又低于年龄≥40岁组。获卵数、减数分裂Ⅱ期卵数、受精卵数、获胚胎数、优胚数在年龄≥40岁组少于35岁≤年龄<40岁组；窦卵泡数、临床妊娠率在≥40岁后减少。在同一年龄层，移植多胚胎组临床妊娠率均高于移植单胚胎组。

Surrey等^[1]认为18～25岁是女性生殖潜能最旺盛的年龄，IVF-ET成功率自30岁后开始下降。Thum 等^[2]的研究结果提示，年龄超过38岁的女性其IVF-ET成功率降低，尤其年龄超过40岁的妇女。Gomes等^[3]和Yan等^[4]都证实年龄是临床妊娠率的影响因素。既往较多研究均发现随着女性年龄的增长，其对COH的卵巢反应性降低，获卵数减少，受精率降低，优胚率降低，胚胎种植率、临床妊娠率均降低，而流产率、早产率和新生儿缺陷发生率增高^{[2, 5, 6, 7, 8]}。这与本文资料的分析结果相符，即年龄增长将导致生育力下降。

年龄增大如何导致女性生育力下降？目前认为女性年龄增长导致卵子染色体异常增多、卵子线粒体功能异常，从而卵胞浆腺苷三磷酸(ATP)含量下降及卵子的细胞凋亡增加，获卵数减少，卵子质量和胚胎质量下降，并进而导致临床妊娠率降低。人卵母细胞的细胞遗传学分析表明，卵母细胞非整倍体的增加与女方年龄有直接的关系^[9]。25岁以下妇女卵子的非整倍体率约为5%，30岁左右约为10%～25%，大于40岁则高达50%以上^{[10, 11, 12, 13, 14, 15]}。非整倍体发生的主要机制涉及在减数分裂Ⅰ期和Ⅱ期染色体不分离^[16]，以及减数分裂Ⅰ期后姐妹染色单体的过早分离^[17]。Grande等^[18]研究亦发现胚胎染色体异常发生率随母亲年龄的增加而增加。针对年龄对卵子线粒体功能的影响，有研究发现高龄妇女卵子的线粒体DNA突变率增高^{[19, 20]}，卵子中线粒体功能的缺陷使得能量如ATP等生成减少，卵子形成尤其是核纺锤体活性和染色体分离受到影响^{[21, 22]}，并进而导致非整倍体的增多，且 ATP生成减少亦会使胚胎种植潜能降低^{[23, 24, 25]}，这些都可能导致高龄妇女临床妊娠率降低。Bentov等^[26]给予52周龄的ICR小鼠线粒体营养物质辅酶Q10，结果发现其获卵数、线粒体活性与年幼对照小鼠相当，因此认为线粒体确实参与了与年龄相关的卵子改变，且线粒体营养物可能可以用于提高高龄不孕妇女的生育力。

Van Rooij等^[27]学者通过比较卵泡刺激素水平≥15 U/L、年龄<41岁组与卵泡刺激素水平<15 U/L、年龄≥41岁组的IVF-ET治疗结局，发现前者妊娠率高于后者，从而认为年龄较基础卵泡刺激素与妊娠结局有更大相关性。Chuang等^[28]亦认为，虽然随着年龄或基础卵泡刺激素水平升高，获卵数、可移植胚胎数均减少，但IVF-ET植入率、妊娠率仅与年龄呈明显负相关，与基础卵泡刺激素无关。Check等^[29]比较年龄≥36岁不同卵泡刺激素水平妇女的临床妊娠率，发现卵泡刺激素≥15 U/L妇女仍能有较好的临床妊娠率，但年龄≥43岁卵泡刺激素正常者的临床妊娠率只有10%。这与我们的研究结果是相似的，即年龄较基础卵泡刺激素对临床妊娠结局有更好的预测性。年龄是临床妊娠结局的独立影响因素，而基础卵泡刺激素虽然会随着年龄增长而增高，但并不是临床妊娠结局的独立预测因素。有研究发现，女方年龄增加会导致非整倍体胚胎比例加大，但基础卵泡刺激素虽能够反映卵巢的储备功能，却与胚胎质量(如非整倍体数目)无关^[2]。Mutlu 等^[30]比较窦卵泡数、抗苗勒管激素浓度、年龄对活产率的预测作用，发现虽然窦卵泡数比抗苗勒管激素浓度更能预测卵巢反应，但只有年龄是活产率的预测因素。因此我们认为卵巢储备决定卵子的数量，而年龄则决定卵子的质量，卵子质量较数量对临床妊娠结局更重要。临床上年龄较大的再生育继发不孕妇女，即使其卵泡刺激素水平较低，仍是IVF-ET临床妊娠失败的高危人群。

本文资料提示移植胚胎数目是临床妊娠结局的独立影响因素，增加移植胚胎数能显著提高妊娠率。但在临床实践和操作中仍需注意防控医源性多胎的发生。辅助生殖技术治疗效果的国际公认衡量标准为单胎、足月、健康新生儿的出生。多胎妊娠会带来一系列母胎并发症和新生儿不良结局，加重家庭负担和社会医疗消耗，尤其对于再生育妇女来说，要严格控制多胎妊娠率。因此，在可接受的临床妊娠率和降低多胎妊娠率两者中寻求一个平衡点极为重要。Kissin 等^[31]研究发现对于年龄小于35岁的妇女，单胚胎移植组的围产结局显著优于多胚胎移植组。美国生殖医学学会(ASRM)则提出对于年龄小于35岁的妇女，移植胚胎数应不多于2个^[32]。本研究以年龄<30岁多胚胎移植组的临床妊娠率作为可接受的临床妊娠率，发现<40岁组的双胚胎临床妊娠率均与此无显著性差异，因此我们认为：年龄<40岁再生育妇女的胚胎移植数应≤2个。而对于年龄≥40岁组，不同移植胚胎数者均较年龄<30岁多移植胚胎数者临床妊娠率低。Kaur等^[33]对300例行体外受精或卵胞浆内单精子显微注射(IVF/ICSI)治疗的25～40岁不孕妇女进行的随机对照试验提示，囊胚期胚胎移植的临床妊娠率显著高于卵裂期胚胎移植(44.0 %与29.33%，P<0.01)；Fernández-Shaw等 ^[34]研究亦发现对于大于35岁妇女，囊胚期胚胎移植较卵裂期胚胎移植有更高的继续妊娠率(48.4%与19.3%，P=0.016)和累积妊娠率(58.0%与25.8%，P=0.01)。因此我们建议年龄≥40岁再生育继发不孕妇女行IVF-ET治疗时可考虑采用囊胚培养、囊胚移植等方法提高临床妊娠率。

此外，目前对于高龄妇女采用何种COH方案治疗效果较佳尚无定论。有文献报道，高龄妇女IVF-ET采用GnRH激动剂长方案的卵巢反应以及助孕结局优于GnRH拮抗剂方案^{[35, 36, 37]}。但另一些学者的研究结果则不尽相同^{[38, 39]}，如Check等^[40] 研究发现40～44岁妇女使用GnRH拮抗剂者的活产率较GnRH激动剂方案高(9%与0%)。我们在年龄≥40岁再生育继发不孕行IVF-ET治疗的妇女中的研究结果显示：虽然GnRH激动剂长方案的获卵数、减数分裂Ⅱ期卵数、受精卵数、获胚胎数、优胚数较GnRH激动剂短方案和GnRH拮抗剂方案高，GnRH拮抗剂组的血基础卵泡刺激素较GnRH激动剂长短方案组稍低，但3种方案在临床妊娠率上并无显著性差异，且均低于<40岁妇女的临床妊娠率。因此我们认为，女方年龄是临床妊娠率的关键影响因素，有必要加强对再生育女性的宣教、及早对高龄再生育妇女进行卵巢储备功能评估及全面的生育能力评估，以便在必要时尽早进行助孕干预；对于≥40岁的妇女，不同COH方案的选用对临床妊娠率影响不大，临床可根据相关女性年龄、卵巢储备功能评估等选择费效比相对较好的卵巢刺激方案，并及时与再生育高龄女性做好沟通，争取最好的医患配合。

综上所述，女方年龄、移植胚胎数为临床妊娠结局的独立影响因素。年龄<40岁者随年龄增加临床妊娠率差异虽无统计学意义，但有降低趋势；年龄≥40岁者临床妊娠率降低，且GnRH激动剂长方案、GnRH激动剂短方案、GnRH拮抗剂3种方案对其助孕效果无显著差异，因此有再生育计划的妇女应在40岁前尽早备孕；35岁以上拟再生育女性若未避孕试孕半年未孕，建议及早到生殖专科评估生殖功能。对于年龄较大的妇女，可通过适当增加移植胚胎数来增加临床妊娠率，但年龄小于40岁的再生育妇女建议移植胚胎数不多于2个，以控制多胎妊娠率、减少母胎风险。需要指出的是，本研究仅为单中心近两年资料的回顾性研究，为得到更加充分可靠的循证医学证据，尚有待更大样本、前瞻性、多中心的随机对照试验进一步证实。