突触素(synaptophysin, SYN)是存在于突触囊泡膜上与突触结构和功能密切相关的钙结合蛋白, 与突触的结构发育和功能的发挥等密切相关。在神经系统的发育及损伤修复过程中, SYN的表达水平与突触形成的时程有密切的相关性[1, 2, 3, 4]。神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)广泛存在于神经元和神经内分泌细胞胞浆内, 对神经元具有营养和保护功能, 临床上常把NSE作为检测神经元损伤敏感性和特异性生化标志物[5, 6, 7]。目前关于NSE和SYN在食管病变方面的研究报道较多[8, 9, 10], 但关于NSE和SYN在人胚胎食管发育过程中细胞分化、发育及演变规律方面的研究报道甚少。本研究通过观察人胚胎食管内NSE和SYN的表达、分布规律, 探讨两者在食管生长发育过程中的作用, 旨在为先天性食管疾病的研究提供形态结构基础和理论依据。
1 材料和方法 1.1 胚胎收集收集因意外原因造成人工流产、发育正常、受精龄为7～16周的人胚胎标本16例, 每例标本均经孕妇本人同意和学院伦理委员会审查批准。根据产妇末次月经、B超所测胎儿双顶径和人胚胎形态学特征等确定胎龄。以每4周为第1个月胎龄组, 妊娠4～8周为第2个月胎龄组, 妊娠9～12周为第3个月胎龄组, 妊娠13～16周为第4个月胎龄组, 每月龄为一研究组, 其例数分布如下: 第2个月胎龄组5例, 第3个月胎龄组6例, 第4个月胎龄组5例。
1.2 标本制备从胎尸内取出食管标本, 分别从每例标本切取约1.0cm长食管, 用4℃生理盐水洗净血液, 放入10%的中性甲醛溶液中固定12h后, 取出流水冲洗30min, 行常规脱水、透明、浸蜡和包埋。石蜡切片, 片厚4μm, 每个标本取6片, 行免疫组织化学染色。
1.3 免疫组织化学染色检测NSE和SYN所用试剂NSE和SYN小鼠抗人单克隆抗体及其辅助试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。免疫组织化学染色程序采用PV法, 即切片常规脱蜡至水, 微波抗原修复, 3％双氧水灭活内源性酶, 滴加一抗(抗体浓度均为1∶150), 滴加PV9002(山羊抗小鼠IgG抗体-HRP多聚体), DAB显色(在以上各步之间均用PBS洗涤5 min×3次), 苏木精轻度复染, 然后脱水, 透明, 中性树胶封片, 光镜下观察。用PBS替代一抗、二抗作阴性对照, 用已知阳性片作阳性对照。
1.4 图像分析切片经免疫组织化学染色后, NSE和SYN阳性细胞的细胞质/膜呈黄色、深黄色或褐色, 细胞核不着色。用NIS-DR专业图像处理分析软件(日本尼康公司)分别测定食管某一高倍视野下食管壁组织内NSE和SYN阳性染色细胞的强度(用强度值表示)和细胞数, 每张切片随机选取3个视野, 对每份样本的4张切片的3个视野阳性染色细胞强度值取平均值。强度与强度值呈反比关系, 强度越强, 强度值越小。
1.5 统计学处理
数据以均值±标准差(
±s)表示, 采用SPSS 11.5统计软件分析, 组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA), 两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。
第2个月胎龄时, 食管壁较薄, 管腔小, 呈开放状态。食管黏膜上皮层约2～3层细胞, 肌层薄, 肌细胞间排列松散(图1A～B)。第3个月胎龄时, 食管壁较前增厚, 管腔呈闭合状态, 食管黏膜上皮层约3～7层细胞, 肌层细胞排列较致密(图1C～E)。第4个月胎龄时, 食管壁进一步增厚, 管腔呈开放状态, 食管黏膜上皮层约3～6层细胞, 肌层较前增厚(图1F)。第2～4个月胎龄时, NSE蛋白在人胚胎食管肌间神经丛和黏膜下神经丛内神经细胞、神经胶质细胞及神经纤维呈弱阳性、阳性或强阳性表达, 阳性表达的数量和强度3个月胎龄甚于2个月胎龄, 4个月胎龄甚于3个月胎龄(图1A～F, 表1)。仅在第3个月胎龄时, 食管黏膜上皮层内可见NSE阳性细胞分布(图1C～D)。
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| A: 人胚胎第2个月龄时, NSE (↑)在食管组织细胞的阳性表达(标尺=2000μm); B: 人胚胎第2个月龄时, NSE(↑)在食管肌间神经丛的阳性表达(标尺=200μm); C: 人胚胎第3个月龄时, NSE (↑)在食管组织细胞的阳性表达(标尺=2000μm); D: 人胚胎第3个月龄时, NSE (↑)在食管黏膜上皮层的阳性表达(标尺=200μm); E: 人胚胎第3个月龄时, NSE (↑)在食管肌间神经丛的阳性表达(标尺=200μm); F: 人胚胎第4个月龄时, NSE (↑)在食管肌间神经丛的阳性表达(标尺=800μm). 图1 人胚胎第2～4个月龄时NSE蛋白在食管组织中的表达(免疫组织化学染色) Fig.1 The expression of NSE protein in the esophagus tissue at the second, third and fourth month of human embryo |
| (±s, 每个高倍视野) | ||||
| 胎龄 | n | NSE阳性染色 强度值 | SYN阳性染色 强度值 | NSE阳性神经 细胞数 |
| 2个月 | 16 | 74.38±14.93 | 54.69±9.34 | 18.38±8.37 |
| 3 个月 | 16 | 62.25±18.59 | 51.84±6.10 | 25.00±11.54 |
| 4 个月 | 16 | 56.44±14.70 | 46.41±6.44 | 38.00±15.09 |
| F 值 | 3.654 | 5.086 | 5.933 | |
| P 值 | ＜0.05 | ＜0.05 | ＜0.01 | |
第2～4个月胎龄时, SYN在食管各层组织内均呈广泛阳性或强阳性表达, 尤其在肌间神经丛和黏膜下神经丛更为明显(图2A～D, 表1)。
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| A: 人胚胎第2个月龄时, SYN (↑)在食管组织的阳性表达(标尺=200μm, 下同); B: 人胚胎第3个月龄时, SYN (↑)在食管黏膜下层及肌层的阳性表达; C: 人胚胎第4个月龄时, SYN (↑)在食管黏膜层的阳性表达; D: 人胚胎第4个月龄时, SYN (↑)在食管黏膜下层及肌层的阳性表达. 图2 人胚胎第2～4个月龄时SYN蛋白在食管组织中的表达(免疫组织化学染色) Fig.2 The expression of SYN protein in the esophagus tissue at the second, third and fourth month of human embryo |
食管是人类进食的必要器官, 也是临床上炎症和癌症的好发部位。在胚胎发育早期, 食管由原始消化管的前肠分化、演变而成。本研究结果显示, 第2～4个月龄段, 随着胎龄的增大, 食管腔呈现开放、闭合、开放状态, 且上皮细胞层数也呈现先增多再减少。说明食管在分化发育阶段, 管腔的开放、闭合与食管壁各层组织细胞的增殖、凋亡的速率有密切关系, 尤其是上皮层细胞的增殖速度。提示此期是食管管腔塑形的关键时期, 也是食管易发生畸形的重要时期。
NSE能特异地存在于神经元和神经内分泌细胞胞质内, 对维持神经系统生理功能具有重要作用。NSE的含量是成熟神经细胞代谢活性和突触化的标志 [5, 6, 7]。NSE可以合成和分泌神经营养因子, 对神经元具有营养和保护功能。SYN是一种糖蛋白, 存在于突触囊泡膜的胞质面, 参与突触囊泡的导入、转运和神经递质释放等过程, 其数量和分布密度可间接反映突触的密度。在胚胎发育时期, SYN是突触发生的重要标志之一。突触是神经元和神经内分泌细胞信息交流最关键部位, 其数量及结构完整性对神经系统功能正常发挥起着重要作用。本研究结果显示, 第2～4个月龄时, NSE在人胚胎食管肌间神经丛和黏膜下神经丛内的阳性表达数量和强度随胎龄的增大而增高; SYN在食管各层组织内均呈广泛阳性或强阳性表达, 尤其在肌间神经丛和黏膜下神经丛更为明显。说明在胚胎发育到第2个月时, 食管肌间神经丛和黏膜下神经丛内已有一定数量的神经细胞形成, 部分神经细胞已与邻近的细胞形成了突触, 随着胎龄的增大, 食管壁的增厚, 食管壁内各层组织内突触形成增多, 食管壁内神经组织通过突触的传递把信号释放到食管壁各层细胞或接收各层细胞的信息, 调控食管壁各层组织细胞的生长发育。更有趣的是, 仅在第3个月胎龄时, 食管黏膜上皮层内见到部分NSE阳性细胞分布。此期NSE阳性细胞可能是阶段性的神经内分泌细胞, 也有可能是由食管神经丛内迁移出来的神经细胞。NSE阳性细胞可以合成和分泌神经营养因子, 促进上皮细胞间的突触形成。第3个月胎龄时, 食管上皮组织细胞处于快速增殖、分化时期, 快速增殖的上皮细胞使上皮层快速增厚, 管腔一度处于闭合状态, 这需要大量的营养和信息传递。NSE阳性细胞的出现是为满足上皮增厚营养和信息之需。
综上所述, 人胚胎食管发育第2～4个月胎龄段, 尤其是第3个月胎龄段, 是食管壁塑形的关键时期。SYN和NSE表达于食管壁各层组织细胞, 参与食管不同类型细胞的发育成熟过程。
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