食用菌多糖不仅在抗氧化、抗肿瘤和抗病原体等方面有显著作用^[1-2]，还是一种很好的免疫调节增强剂^[3]。近年来，食用菌多糖在抗氧化和抗肿瘤方面的研究越来越受到关注^[4-8]。然而，随着贮藏时间的延长，食用菌多糖的含量和生物活性会发生变化。张佳欣^[9]指出，茯砖茶中多糖的抗氧化能力随着贮藏年限的增加先升后降，并在第3年达到最佳。

HepG2细胞是广泛应用于癌症机制、遗传学和营养学等研究的一类细胞株，其分化程度高，具有相对正常肝实质细胞的表型，还能够行使正常肝细胞的代谢解毒功能，分泌正常肝细胞特征的蛋白^[9-10]。此外，HepG2细胞増殖能力强，易于获得且多次传代后仍能保持原有的生理状态，可被用作替代肝细胞的理想细胞系^[11]。过氧化氢（H₂O₂）是氧气的二电子还原产物，是一种氧化性很强的活性氧^[12]，可以穿透大部分细胞膜，增加细胞毒性，如乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）渗漏显著，脂质过氧化，DNA损伤增加及还原型谷胱甘肽（glutathione reduced, GSH）水平降低^[13]，而且还有易于获得、性质比较稳定等特点；因此，H₂O₂氧化损伤模型已成为目前应用最广泛的一种细胞损伤模型^[14]。

之前人们对于食用菌多糖的研究主要侧重于提取、纯化和分离^{[5-6, 15-17]}，而很少涉及不同贮藏时间对食用菌多糖提取率和多糖生物活性影响的研究。因此，本文以香菇、杏鲍菇和黑木耳为研究对象，初步研究不同贮藏时间对食用菌多糖提取率的影响，并建立H₂O₂诱导HepG2细胞氧化损伤模型对HepG2细胞预保护再损伤，从细胞学的角度探究不同贮藏时间对食用菌多糖抗氧化活性的影响，为合理确定不同食用菌贮藏年限提供理论依据。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 材料来源

3种试验材料香菇808、黑木耳916和杏鲍菇kE015均由浙江百兴食品有限公司提供。

1.1.2 细胞与试剂

人肝癌HepG2细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库；DMEM培养液、胎牛血清、青霉素/链霉素双抗溶液、0.25%胰蛋白酶[含0.5%乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA）]及磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solution, PBS）购自美国GIBICO公司；CCK-8试剂盒购自日本同仁研究所；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（malondialdehyde, MDA）和乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒购自碧云天生物技术研究所；其余药品、试剂均为国产，分析纯。

1.2 试验设计 1.2.1 食用菌多糖的提取

设置3×4双因子试验，即3种食用菌材料（香菇808、杏鲍菇kE015、黑木耳916）、4种贮藏时间（1、2、3和4年），每组试验重复3次。食用菌多糖含量的提取采用超声辅助复合酶法^[17]。

具体步骤为：称取3.00 g食用菌干粉，加入60 mL蒸馏水混合均匀，进行超声波细胞破碎（超声工作5 s，间隙5 s，超声波功率720 W，总工作时间20 min）后，置于50 ℃水浴0.5 h；称取果胶酶和纤维素酶，按料液比1:21.17、复合酶比1.96:1加入食用菌溶液中，反应1 h后抽滤，滤液于沸水中灭酶10 min，温度降至室温后，将酶提取液于5 000 r/min条件下离心5 min，取上清液，于75 ℃、0.09 Pa条件下浓缩到总上清液体积的2/5~1/2；加入3倍体积的95%乙醇溶液，置于4 ℃冰箱中静置24 h后，取出，以4 000 r/min离心20 min；将沉淀溶解、定容、稀释后，采用蒽酮-硫酸法测定多糖总量。

1.2.2 食用菌多糖对H₂O₂诱导的HepG2细胞存活率影响的测定^[18-21]

设置3×4×4三因子试验，即：3种食用菌材料（香菇808、杏鲍菇kE015和黑木耳916）；4种贮藏时间（1、2、3和4年）；给药组（4种食用菌多糖提取物终质量浓度为0.25、0.5、1和2 mg/mL的完全培养液）；H₂O₂诱导的对照组（加入完全培养液）。每组设3个重复。

具体操作参照CCK-8试剂盒的说明书进行。将HepG2细胞以6×10³个/孔的密度接种于96孔板上，培养24 h后，换成含有食用菌多糖提取物，继续培养24 h，经PBS洗涤2次后加入60 μmol/L H₂O₂培养液作用2 h；根据CCK-8法测定各组的细胞存活率。

1.2.3 食用菌多糖对H₂O₂氧化损伤的HepG2细胞中SOD、MDA、LDH水平影响的测定^{[19, 21-23]}

设置3×4×3三因子试验，即：3种食用菌材料（香菇808、杏鲍菇kE015和黑木耳916）；4种贮藏时间（1、2、3和4年）；正常对照组（加入完全培养液）；模型组（H₂O₂诱导组，加入完全培养液）；给药组（食用菌多糖质量浓度为0.5、1和2 mg/mL）。每组3个重复。

酶活性的测定参照SOD、MDA和LDH试剂盒的说明书进行，具体操作方法如下。将对数生长期的细胞按5×10⁵个/孔的密度接种于6孔板上，按上述设置的试验分组培养24 h；将苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride, PMSF）加入细胞裂解液中，使裂解液中的PMSF最终浓度为1 mmol/L；将各组细胞消化收集到EP管中，2 000 r/min离心5 min，然后放入冰盒；弃上清液，再加入1 mL PBS，离心以去除胰酶；每管加入100 μL裂解液，涡旋混匀；于4 ℃、1×10⁴ g条件下离心5 min，取上清液用于各类酶活性的测定。

1.3 数据统计

采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和因子方差分析（factorial ANOVA）对数据进行正态性和方差齐性分析，采用STATISTICA 8.0软件对数据进行统计分析。结果以“平均值±标准差”表示，显著性水平为P＜0.05。

2 结果与分析 2.1 不同贮藏时间对食用菌多糖提取率的影响

由图 1和表 1可知：香菇多糖的提取率最高[贮藏3年的提取率为（6.92±0.18）%]，杏鲍菇多糖次之，黑木耳多糖的提取率最低，且不同食用菌类型的多糖提取率存在显著差异（P＜0.05）；不同贮藏时间对香菇、杏鲍菇多糖提取率的影响没有显著差异，但贮藏1年的黑木耳多糖提取率[（2.61±0.73）%]和贮藏3年的黑木耳多糖提取率[（1.72±0.09）%]之间差异达显著水平（P＜0.05）。

2.2 不同贮藏时间的食用菌多糖对HepG2细胞存活率的影响

由图 2A可知，随着质量浓度的增加，香菇多糖对HepG2细胞存活率的影响总体呈现增加的趋势。而杏鲍菇和黑木耳多糖对HepG2细胞存活率的影响总体呈现先上升后下降的趋势（图 2B和2C）。随着贮藏时间的延长，香菇多糖在0.25 mg/mL时对HepG2细胞存活率的影响呈现先增加后下降的趋势，但在高质量浓度范围内对HepG2细胞存活率的影响变化不大。贮藏时间为3年、4年的香菇多糖在质量浓度为0.25 mg/mL时，HepG2细胞存活率最低；贮藏时间为2年、3年的杏鲍菇多糖对HepG2细胞存活率的影响最为明显，均和对照存在显著差异（P＜0.05），其中以贮藏时间为3年、多糖质量浓度为1 mg/mL处理组的HepG2细胞存活率最高，为（99.37 ± 8.23）%，是对照组HepG2细胞存活率[（51.98±7.10）%]的1.91倍，表明杏鲍菇多糖可以有效降低经H₂O₂诱导的HepG2细胞产生的氧化损伤作用。黑木耳多糖组的HepG2细胞存活率受贮藏时间变化的影响并不明显，但不同多糖质量浓度间存在显著差异（P＜0.05）。贮藏时间为1年的黑木耳多糖处理组的HepG2细胞存活率较低，其中1 mg/mL多糖处理组的HepG2细胞存活率最低，仅为（35.43±12.8）%；随着贮藏年限的增加，HepG2细胞存活率有所增加，当贮藏时间为4年、黑木耳粗多糖质量浓度为1 mg/mL时，HepG2细胞的存活率最高，达（104.85±4.08）%，显著高于对照组（P＜0.05）。

以上结果结合表 2可知，杏鲍菇多糖作用的HepG2细胞存活率最高，其次是黑木耳多糖，而香菇多糖组的HepG2细胞存活率最低，且三者之间存在显著差异（P＜0.05）。不同贮藏时间的食用菌多糖处理对HepG2细胞氧化损伤的保护效果存在显著差异，其中以贮藏1年的食用菌多糖处理的HepG2细胞存活率最低，且与其他贮藏时间间差异显著（P＜0.05）。不同的多糖质量浓度对HepG2细胞存活率的影响差异不显著。

2.3 不同贮藏时间的食用菌多糖对HepG2细胞中SOD、MDA和LDH水平的影响

由图 3可知，不同贮藏时间的香菇多糖显著提高了SOD、MDA和LDH的水平，表现出良好的抗氧化活性（P＜0.05）。贮藏时间为1年的香菇多糖对氧化损伤的保护能力优于2年、3年和4年，其中：贮藏时间为1年、香菇多糖质量浓度为1 mg/mL时，HepG2细胞中SOD活性最高，达（2.37±0.13）U/mg；在质量浓度为0.5 mg/mL时，HepG2细胞中MDA含量最接近空白对照组[（8.08±0.43）mmol/mg]，为（8.19 ± 0.16）mmol/mg；在质量浓度为0.5 mg/mL时，HepG2细胞中LDH活性最接近对照组[（40.02± 3.19）U/mg]，为（46.29±4.48）U/mg。贮藏时间为3年的杏鲍菇多糖对HepG2细胞的保护能力最佳，当质量浓度为2 mg/mL时，HepG2细胞的SOD活性最高，达（1.50±0.06）U/mg，明显高于模型组[（0.46± 0.01）U/mg]；贮藏时间为3年、4年的杏鲍菇多糖组的MDA含量比1年、2年组高；但杏鲍菇多糖对LDH活性的影响不显著。在黑木耳组中，贮藏时间为4年的黑木耳多糖在质量浓度为1 mg/mL时，HepG2细胞的SOD活性达到最高[（0.93±0.10）U/mg]，MDA含量为[（10.93 ± 0.30）mmol/mg]，最接近对照组[（10.68 ± 0.88）mmol/mg]，而LDH活性最低，为[（78.11±1.57）U/mg]。总体而言，贮藏时间为4年的黑木耳粗多糖对HepG2细胞的保护能力优于其他3个贮藏年限。

从表 3可知，食用菌类型、贮藏时间和多糖质量浓度均对HepG2细胞中SOD、MDA、LDH水平的影响具有显著差异（P＜0.05）。香菇处理组的SOD活性显著高于杏鲍菇和黑木耳，但其MDA、LDH水平显著低于杏鲍菇和黑木耳（P＜0.05），表明香菇多糖对H₂O₂氧化损伤作用的降低效果显著高于杏鲍菇多糖和黑木耳多糖。在不同贮藏时间的食用菌多糖组中，HepG2细胞的MDA含量存在显著差异（P＜0.05），且以贮藏3年的最高。不同多糖质量浓度处理组的SOD活性和MDA含量存在显著差异（P＜0.05），其中高质量浓度（1、2 mg/mL）多糖处理组的HepG2细胞的SOD活性显著高于低质量浓度处理组，表明高质量浓度多糖比低质量浓度多糖具有更佳的抗氧化效果。

3 讨论和结论

多糖类物质在食用菌中普遍存在，其在生物活性方面的作用越来越受到人们的重视。近年来的研究发现，食用菌多糖不仅具有抗癌、抗感染、抗病毒、抗衰老等多方面的药理活性^[24-26]，而且具有较好的抗氧化活性，对物理、化学及生物来源的多种活性氧簇（reactive oxygen species, ROS）具有良好的清除作用。而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、降血脂、降血糖的作用机制之一^[27-28]。近年来，国内外已将抗氧化水平的检测用于抗衰老等保健食品的评价中。

本研究结果表明，在香菇、杏鲍菇和黑木耳3种食用菌中，香菇多糖的提取率显著高于其他2种，且贮藏3年的香菇多糖提取率最高，为（6.92 ± 0.18）%。杏鲍菇多糖降低H₂O₂诱导的HepG2细胞的氧化损伤作用最佳，且贮藏时间为2年和3年的杏鲍菇多糖的保护效果优于其他2个年限；不同质量浓度的杏鲍菇多糖处理对细胞的保护效果都显著高于对照，其中以贮藏时间3年、质量浓度为1 mg/mL的杏鲍菇多糖的抗氧化效果最佳，其HepG2细胞存活率为（99.37±8.23）%，是模型组的1.91倍，这与杏鲍菇多糖显著提高了SOD活性、降低了MDA含量的结果一致。在黑木耳组中，贮藏时间为1年的黑木耳多糖提取率最高[（2.61 ± 0.73）%]，贮藏3年的最低[（1.72±0.09）%]；在抗氧化活性方面，贮藏4年、质量浓度为1 mg/mL的黑木耳多糖对H₂O₂诱导的HepG2细胞保护作用显著高于对照组（P＜0.05），此条件还显著提高了SOD活性、降低了MDA和LDH的水平，表现出最强的抗氧化作用。

张佳欣^[9]在细胞抗氧化活性的研究中发现，茯砖茶多糖表现出陈化时间的规律，且陈化3年对PC12细胞的保护作用最强；本研究结果与其一致。说明食用菌多糖具有抗氧化活性，而且其活性随着贮藏时间的不同而变化。另外，与韩飞等^[23] （100 μmol/L H₂O₂，4 h）、罗春丽等^[21]（400 μmol/L H₂O₂，2 h）构建的模型不同，本试验在建模时选取的是使HepG2细胞达到半抑制时的H₂O₂浓度（60 μmol/L，2 h），在此浓度下细胞处于氧化损伤而又未被完全杀死的状态，这时有损伤修复的可能性^[19]。

然而，食用菌贮藏改变其多糖活性成分的形成机制尚未见有相关报道，推测可能与多糖的一级结构发生改变，从而影响有效多糖的比例，进而造成生物活性的差异有关。较早的研究表明：食药用真菌的多糖结构与功能存在一定的关系；此类多糖中活性成分的主链由β-（1-3）糖苷键相连接，侧链由β-（1-6）糖苷键相连接，且该类型的多糖具有抗菌、抗肿瘤和抗病毒功效^[29]。此外，多糖分子的结构修饰可能对其生物学活性产生重要影响，如糖残基上的羟基、羧基、氨基等基团经磺化后可增加抗人类获得性免疫缺陷病毒（HIV）和抗肿瘤的效果^[30]。

综上所述，食用菌多糖的提取率、抗氧化活性等会随着食用菌的种类及贮藏年限的不同而发生改变。对于不同的食用菌多糖，在贮藏过程中发生的物质变化及有效成分的生物活性机制还需进一步深入研究。本研究为香菇、杏鲍菇、黑木耳等食用菌在生产实践中优化贮藏时间及条件、获得良好的生产工艺提供了一定的参考，也为获得更大生产收益提供了理论支持。