浙江省是中国最重要的白沙枇杷即白色果肉枇杷产区。全省现有白沙枇杷种植面积1.2×10⁴ hm²左右，年产量约6.5×10⁴ t，年产值25亿元左右。浙江省台州市的白沙枇杷主产区在原黄岩县种植区域(现黄岩区、路桥区及椒江区)与临海、玉环、温岭等县市；宁波市的主产区在宁海、象山、鄞州；杭州市的主产区在余杭塘栖、淳安、建德；金华市的主产区在兰溪；丽水市的主产区在莲都区及青田、松阳等地；温州市的主产区在乐清、苍南、瑞安等地。各地种植的白沙枇杷品种如下：台州以“黄岩软条白沙”“槐梵”“溪上白沙”为主；宁波以“宁海白”为主；兰溪以当地未命名的白沙枇杷品种为主；丽水、温州除地方资源外，主要为“黄岩软条白沙”“宁海白”；杭州市的主栽品种为“余杭软条白沙”“余杭硬条白沙”，其他各县都是混合种植各类白沙品种。

白沙枇杷市场价格潜力大，尤其在沿海经济发达地区，其价格是红沙枇杷的5~10倍及以上；因此，在考虑优生区的前提下，发展白沙(也称白肉)枇杷具有十分重要的现实意义。然而，白沙枇杷存在裂果、腐烂率较高的问题，要推动白沙枇杷产业可持续发展的突破口在于选育厚皮、抗逆性较强的种质资源。梁国鲁等^[1]对四川7个红沙枇杷品种和1个白沙枇杷品种的染色体进行研究表明，白沙品种是红沙品种的突变体类型，其染色体带不具橙红带，核型是3B类型，而红沙染色体带具鲜明的橙红带，核型是2A类型。周坤杰等^[2]对苏州地区9个白沙枇杷种植情况调查表明，“丰玉”相对为优。任国慧等^[3]用SPSS 16.0软件对江苏省20份白沙枇杷种质的果实性状进行了多因子聚类分析，其分值最高、优先推荐种植的品种为“冠玉”，分值最低的是“早黄”。袁卫明等^[4]在苏州选育出了杂交新种质“常绿5号”。该品种具早熟、避雨、丰产、矮化、抗冻的特点，与母本(父本“甜种”，母本“白玉”)相比，其单果质量增加22.60%，植株矮化率达31.14%，冠幅增加25.58%~30.76%，冻害率下降10%左右：可见，其综合性状偏向高值亲本，有适度栽培价值。LI等^[5]采用基于表达序列标签(expressed sequence tags，EST)的简单序列重复(simple sequence repeats，SSR)标记技术研究了来自不同地区的47份枇杷材料的亲缘关系，证实了来自同一地区的枇杷材料亲缘关系相近。综上所述，虽然前人对于白沙枇杷的品种选育进行了相关研究，但目前还没有选育出厚皮、抗逆性较强的新种质。笔者在多年的研究中发现，同是白沙枇杷类的品种(材料)，“黄岩软条白沙”在自然栽培条件下常年裂果且腐烂现象严重，而浙江省兰溪市主栽的“兰溪白沙枇杷”(未命名，笔者暂定名)在成熟期裂果腐烂现象并不显著；因此，本文在综合观察这2个品种(材料)形态特征的基础上，对它们进行了倍性、气孔特征和基于分子标记的亲缘关系研究，旨在为新种质的挖掘推广提供技术参考。

1 材料与方法 1.1 材料

以10年生为主的黄岩软条白沙枇杷265株(0.33 hm²)、兰溪白沙高接5株(浙江省台州市黄岩区屿头乡上凤村浙江省柑橘研究所山地试验点)；以10年生为主的兰溪白沙枇杷园239株(0.33 hm²)(浙江省兰溪市女埠街道虹霓山枇杷专业合作社)。

SSR分子标记检测除上述材料外，还包括试验点内的溪上白沙、傀梵白沙、白荔枝、软条白沙变异(永路)、福建红白沙枇杷5个材料。

1.2 方法 1.2.1 黄岩软条白沙和兰溪白沙种性特点调查

在黄岩、兰溪2地随机采集5株白沙枇杷，每株随机选取20片成年叶和2 kg成熟果实，测定叶片纵横径、单果质量、果实种子数、果皮厚度等；调查当地气候特点。

1.2.2 黄岩软条白沙和兰溪白沙的倍性检测

参照陈方永^[6]的方法用流式细胞仪(CyFlow^® Space，德国Partec公司)检测。

1.2.3 黄岩软条白沙和兰溪白沙的叶片气孔检测

参照陈方永^[6]的方法用光学显微镜(Leica DMI3000)检测。

1.2.4 基于SSR分子标记的黄岩软条白沙和兰溪白沙的亲缘关系检测 1.2.4.1 DNA提取

参照陈方永等^[7]和何桥^[8]的方法提取叶片总DNA，检测DNA纯度与浓度，结果见表 1。

1.2.4.2 聚合酶链式反应体系建立

SSR-聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增体系总体积为30 μL：10×PCR缓冲液3.0 μL，50× dNTP混合物0.5 μL，引物F(5′端掺入荧光)0.5 μL和引物R 0.5 μL(表 2)，TaKaRa Taq酶0.4 μL，50 ng/μL DNA模板1.0 μL，加ddH₂O补至30 μL。反应程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性15 s，55 ℃退火30 s，先72 ℃延伸60 s，再72 ℃延伸7 min，40个循环；最后4 ℃保存。上样于1%琼脂糖凝胶孔中，120 V恒压电泳15 min，在紫外透射光下观察并拍照。

1.2.4.3 短串联重复序列检测

取96孔反应板，用记号笔标明板名、实验日期，制作电子版短串联重复序列(short tandem repeat，STR)检测表，并自动生成上机表。使用连续加样器，吸取990 μL HIDI和ROX500混合物，加入到96孔反应板中，每孔10 μL，将96孔板置于平板离心机中，离心500 g即停；使用12排10 μL排枪，对照STR检测表，在96孔板对应的孔中加入50 pg样品，将96孔板置于平板离心机中，离心500 g即停；使用封板膜密封96孔板，振荡，将96孔板置于平板离心机中，离心500 g即停；然后置于PCR仪上，变性程序为98 ℃，5 min，不加热热盖，程序结束后立即将96孔板置于冰水混合物上急速冷却；将96孔板置于平板离心机中，离心2 000 g即停。使用3730XL测序仪检测STR样本

1.2.4.4 引物扩增

根据已发布的苹果SSR引物扩增信息及对应的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果^[9]，选取表 2中的3对候选引物扩增枇杷基因组DNA。

2 结果与分析 2.1 种性特征比较

从表 3和图 1可以看出：兰溪白沙比黄岩软条白沙枇杷平均单果质量低27.33%；黄岩软条白沙裂果腐烂率、单果质量分别是未命名的兰溪白沙的2.72倍、1.38倍；反之，兰溪白沙的种子数、果皮厚度、果实硬度分别是黄岩软条白沙的1.36倍、1.096倍、1.22倍；此外，两者的可溶性固形物(total soluble solid，TSS)含量也存在显著差异，兰溪白沙是黄岩软条白沙的1.14倍；兰溪白沙新叶纵横径为20.4 cm×5.6 cm，叶尖弯锐尖，叶缘浅锯齿状，主脉浅沟状，左右脉不对称(左大右小)，脉径沿叶尖方向变小，叶色浅绿，叶片不平整；黄岩软条白沙新叶纵横径为20.8 cm×5.2 cm，叶尖弯尖，叶缘锯齿状明显，主脉直线状，左右脉较对称，脉径沿叶尖方向变小，叶色墨绿，叶片较平整。

2.2 流式细胞仪检测结果

流式细胞仪检测结果(图 2)证实，黄岩软条白沙与兰溪白沙均为二倍体。开机后检测到出峰时间为1.0~1.5 min，在DNA相对含量为50~100处可见二倍体峰值均在70~75左右。

2.3 气孔检测结果

从图 3可以看出，2个不同品种的枇杷材料气孔形态相似，均属于平行型气孔，但气孔大小和气孔密度差别显著。黄岩软条白沙气孔密度为431个/mm²，比兰溪白沙气孔密度小17.35%；黄岩软条白沙气孔面积平均为76 μm²，而兰溪白沙为53 μm²。

2.4 基于SSR标记的亲缘关系检测结果 2.4.1 SSR位点遗传参数分析结果

从表 4得知：7个供试材料的有效等位基因数在2.279 1到4.454 5之间，标准差为1.101 8；Shannon信息指数在0.898 2到1.611 5之间，标准差为0.357 4；期望杂合度在0.604 4到0.835 2之间，标准差为0.115 4。可见，选取的3个SSR位点遗传多样性相对较高。

2.4.2 基于遗传参数的分析结果

将7份材料进行UPGMA聚类分析，绘制聚类树状图(图 4)。在遗传相似系数(genetic similarity coefficient，GS)≈1.0处，可以把7份白沙枇杷种质划分为6类：第1类，软条白沙变异(少籽卵圆型)(RTBY)与白荔枝(BL)首先聚在一起，两者亲缘关系最近；第2类，傀梵白沙(KF)；第3类，溪上白沙(XS)；第4类，软条白沙(RTBS)；第5类，兰溪白沙(LX)；第6类，福建红白沙(FJ)，与前6份种质材料亲缘关系最远。

3 讨论

2个植物貌似相同，但又无法确定，传统经典的方法是进行形态比较鉴定，主要是对花、叶、果3大器官组织进行比较，然后确定是否为同一品种(种质)。这种方法虽然简便快捷，但也往往存在不同种植地、不同栽培水平造成的非遗传因子变化，称为饰变。本研究黄岩软条白沙和兰溪白沙果实综合指标差异较大，前者单果质量与种子数分别为30.62 g/果、2.38粒/果，后者分别为22.25 g/果、3.24粒/果；从果皮厚度、果实硬度2项指标衡量也明显不同，后者的果皮厚度为0.375 mm、果实硬度为6.17 N，与前者的0.342 mm、5.04 N差异显著。由于2个品种(种质)种植地不同，黄岩软条白沙处于浙江东南部的海洋性气候带，兰溪白沙处于浙西盆地的季风气候带，后者提前5 d左右进入夏季，晚5 d左右退出冬季。本研究从分子标记、倍性检测及叶片气孔特征等方面综合分析判定两者是否存在亲缘关系。结果表明，它们虽然都是二倍体植物，但两者之间亲缘关系较远。基于SSR标记的亲缘关系聚类结果显示，黄岩软条白沙的GS为0.40，而兰溪白沙为0.45。为此，笔者观察了自有资源圃内从原产地采穗高接种植的5株兰溪白沙，它们除了成熟期较常年延后2~3 d外，花、叶、果等各个器官组织的基本特征没有改变，显示了该种质遗传的稳定性。需要指出的是，虽然本研究分析遗传相似性的聚类材料只有7个，但笔者的前期研究^[6]已经有了较好的基础，用相关序列扩增多态性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)分子标记检测，已基本明确了现有的浙江省8份、福建省21份及新西兰、日本2个国家各1份(共31份)白沙枇杷品种(种质)的亲缘关系，故从综合因素考虑，没有重复研究相同材料。气孔检测结果表明：黄岩软条白沙气孔密度为431个/mm²，兰溪白沙为521.5个/mm²，小于后者17.35%；气孔面积前者平均为76 μm²，后者为53 μm²，前者比后者大43.4%。目前，国内的类似研究多为倍性检测或基于分子标记的亲缘关系分析，而从表型特征检测到亲缘关系的相关系列研究还不多见。笔者前期研究表明，虽然白沙枇杷品种相同或相近，但在不同栽培地和不同栽培方法下，果实大小、色泽、综合品质明显不同^[10]。传统的形态鉴定无法准确判定一个种质的亲缘关系，尤其是对在芽变或相似遗传背景条件下不同栽培地种植的种质鉴定；因此，需要进行分子标记、气孔及其转录组技术的综合配套检测分析，也是体现果树种质遗传关系的重要指标^[11-13]。对多倍体枇杷目标起始密码子多态性(start condon targeted polymorphism，SCoT)、红皮沙梨品种SSR分子标记亲缘关系并结合配套技术研究取得了较好的效果^[12-13]。CHEN等^[13]用SCoT、引物结合位点(inter-primer binding site，IPBS)2个分子标记联合对浙江省31个杨梅资源品种进行了亲缘关系研究，排除了1个同物异名种质，区分出了2个突变体与野生型的差异。在本研究中黄岩软条白沙果实显著大于兰溪白沙，而其气孔面积比后者大43.4%，气孔密度比后者小17.35%。通常，气孔越大抗逆性可能较差。这与笔者前期对杨梅气孔的研究结果吻合，大果型东魁杨梅的气孔密度显著小于小果型的地方品种，研究表明这是由其种性特点决定的^[14]。对于芽变或倍性变异的种质，需要分子标记与转录组组合鉴定才能更加精准。如潘志勇利用RNA-Seq组学技术，对广西甜橙变异材料暗柳橙进行了芽变研究^[15]，FENG等利用RNA-Seq技术进行了杨梅色泽变化的机制研究^[16]，均取得了较好的效果。笔者在对杨梅的亲缘关系研究中，把气孔分析、分子标记检测、RNA-Seq检测3项内容作为倍性变化研究的技术关键，明确了2个突变体与野生型植株的倍性及其变异机制^{[13-14, 17]}。下一步我们将对本研究的2个种质进行深入分析，并利用新的转录组学技术，明确产生种质差异的候选基因，探讨形成差异的机制；同时，在面上适度开展高接换种与异地栽培，扩大对这2个种质的特征和特性观察，将优良品种和优良栽培技术结合，培育出消费者期望的品种。