2016, Vol. 42引用本文 |
| 可用于功能性成分研究的Caco-2细胞中空纤维反应器的构建 |  [PDF全文] |
2. 浙江大学医学院附属第二医院，杭州 310009
2. The Second Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310009, China
Caco-2细胞是人源结肠腺癌细胞，同源性好，生命力强，经过3周左右的培养后，可形成连续的细胞单层，并在形态和功能上分化出接近成熟小肠上皮细胞的状态[1]，也相应表达出类似小肠上皮细胞的水解酶(如麦芽糖酶、乳糖酶、氨基肽酶等)的作用。
作为附着依赖性细胞，单层贴壁培养模型是Caco-2细胞最常见的培养模型。为了改善极性细胞培养情况，HUBATSCH等[2]将Caco-2细胞培养在覆有透过性微孔滤膜的插入式嵌套培养板上，如图 1所示。被培养在半透过性滤膜上的Caco-2细胞单层将整个培养体系分成了顶膜侧(apical side)和基底膜侧(basolateral side)，化学物质由顶膜侧进入体系，通过检测基底膜侧被测物质的浓度即可进行物质吸收、转运及代谢研究[3]。较为经典的产品有Transwell®、Millicell®等。
中空纤维是一种由微滤膜材料制成的细微管状结构，如图 2所示，管壁是极薄的半透膜；每根纤维具有很高的比表面积，其构造类似于动物的毛细血管，可以为贴壁细胞提供类似体内的微环境[4]。膜上的微孔结构使离子和营养物质可以穿过膜到达细胞单层的两侧，避免了培养液流动而产生的不良应力影响，从而使细胞以更为自然的方式进行代谢。同时，通过中空纤维膜构建的细胞培养环境温和，培养细胞密度较高，可达1×107~1×108 mL-1[5]。
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| A: 横截面；B:聚醚砜中空纤维膜内表面；C:聚偏氟乙烯中空纤维膜内表面. A: Cross-section of hollow fiber; B and C: Inner surface of polyethersulfone (PES) and polyvinylidenefluoride (PVDF) hollow fibers,respectively. 图2 中空纤维膜结构 Fig. 2 Structure of hollow fiber |
Caco-2细胞模型常被应用于口服药物的摄取、吸收转运以及毒性研究[6-7]，近年来也被大量应用于氨基酸、核苷酸、微量元素等营养素的小肠吸收机制[8]以及丙烯酰胺等毒性成分的研究[9]。传统的单层细胞模型与正常肠道存在较大差异，而采用中空纤维构建的生物反应器在形态上更接近小肠的管腔结构，可以为Caco-2细胞提供大量中空纤维间的孔隙作为生长空间，增加了Caco-2细胞与培养基的接触面积，有利于物质交换[10]，进而可以缩短细胞的培养分化周期，从而更好地应用于口服药物以及功能性成分的小肠吸收机制研究。
本文构建了3维Caco-2中空纤维反应器模型，通过对比聚醚砜(polyethersulfone,PES)和聚偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)中空纤维培养环境与传统Transwell模型的差别，研究不同材料和构型对Caco-2细胞增殖分化的影响，为建立可靠、稳定的Caco-2细胞模型并用于食品功能性成分的吸收、转运研究提供依据。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂Caco-2细胞(由中国科学院上海细胞生物学研究所提供，30~60代)；聚醚砜亲水性中空纤维微滤膜(孔径0.1μm，在0.1 MPa下纯水通量为1 000 L/(m2·h)，内/外径0.8 mm/1.4 mm)、聚偏氟乙烯亲水性中空纤维微滤膜(孔径0.2 μm，在0.1 MPa下纯水通量为800 L/(m2·h)，内/外径0.7 mm/1.3 mm)(天津森诺过滤技术有限公司)；Transwell聚碳酸酯膜细胞培养小室(Cat.No.3415，美国Corning公司)。
DMEM高糖培养基、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；胎牛血清(美国Hyclone公司)； 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT](美国Sigma-Aldrich公司)； Ⅰ型鼠尾胶原(美国Corning公司)；赫斯特荧光燃料33342(上海晶纯生化科技股份有限公司)；ZO-1免疫荧光染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；碱性磷酸酶试剂盒(上海碧云天生物技术研究所)； γ -谷氨酰转肽酶试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)。
1.2 仪器超净台(SW-CJ-2D型，江苏省苏州市净化设备公司)，冷冻微量离心机(Legend Micro 17R，美国Thermo公司)，5% CO2恒温培养箱(BB15，美国Thermo公司)，立式压力蒸汽灭菌锅(MLS-3750，日本Sanyo公司)，倒置相差显微镜(IX2-SLP，日本Olympus公司)，酶标仪(SpectraMAX PLUS 384，美国分子仪器公司),荧光显微镜(AX10，德国Zeiss公司)，扫描电子显微镜(TM-1000，日本Hitachi公司)，步进电机及其控制器和驱动系统(上海四宏电机有限公司)。
1.3 细胞培养将Caco-2细胞接种于细胞培养瓶中，加入含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基，然后置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养；隔天换液，当细胞达到约80%~90%融合时(约2~3 d)，用胰酶消化并按一定比例进行传代。
1.4 Caco-2细胞单层培养模型的构建在接种细胞前用0.75mg/mL的Ⅰ型鼠尾胶原溶液铺被Transwell小室的顶膜侧滤膜，晾干后将处于对数生长期的Caco-2细胞以1.5×105 cm-2的密度接种于滤膜上，基底膜侧加入DMEM培养基；接种后隔天换液，1周后每天换液，培养21 d。
1.5 Caco-2细胞3维培养模型的构建将中空纤维切成3 cm小段，浸入磷酸盐缓冲溶液(phosphate-buffered saline,PBS)中，通过蒸汽高压灭菌后在超净台上铺开风干。在接种细胞前，先用0.1%乙酸溶液配置0.75mg/mL鼠尾胶原溶液，注入中空纤维内腔，静置于6孔板中待胶原凝固。试验时，将密度为5×106 mL-1的Caco-2细胞悬液注入中空纤维内腔，置于37 ℃培养箱中，使用步进电机驱动系统连续运转，使中空纤维沿轴向旋转，便于细胞均匀贴附； 旋转4 h后，将培养有细胞的中空纤维置于6孔板中，每孔加入2~3 mL培养基，每天轻微晃动培养板，每1~2 d更换一次培养基，培养21 d。
1.6 细胞形态学观察于倒置相差显微镜下观察培养瓶中的细胞生长状态，了解其生长习性并记录拍照。
将生长于中空纤维上的细胞单层用戊二醛固定并用乙醇梯度脱水处理后，于扫描电子显微镜下观察Caco-2细胞在中空纤维膜内表面的生长状况和细胞单层形成情况。
用10 μg/mL Hoechst 33342荧光染料温育中空纤维内腔的Caco-2细胞，弃去染料溶液,并用PBS漂洗后剖开中空纤维，迅速置于倒置荧光显微镜(紫外激发光)下通过细胞核观察Caco-2细胞的生长和分布情况。
1.7 MTT试验将接种有Caco-2细胞的中空纤维取出，放入新的6孔板中，用PBS漂洗；将配好的MTT溶液注入中空纤维，然后将该6孔板置于培养箱中反应3~4 h，使MTT还原为蓝紫色甲臜结晶并沉积在细胞中，然后用PBS漂洗2次，将中空纤维剖开观察结晶情况，再加入含有0.1% HCl的异丙醇溶液萃取10 min，得到蓝紫色萃取液；设置波长为570 nm，测该萃取液的吸光度值。
1.8 刷状缘酶系检验取出中空纤维置于新的6孔板中，用PBS漂洗，将中空纤维剖开剪碎，用0.5% Trition X-100溶液(经PBS稀释)进行裂解，必要时可进行超声或振荡处理； 30 min后收集裂解液，将样品置于-80 ℃冰箱中冻存。根据试剂盒说明操作并测得标准品和样品的吸光度值，根据酶活性的定义计算出样品中碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和谷氨酰转肽酶( γ -glutamyl transpeptidase,γ -GT)的活性。
1.9 ZO-1蛋白荧光染色试验将培养有Caco-2细胞的中空纤维膜和Transwell嵌套小室从培养箱中取出，用PBS漂洗，随后用预先配好的4%多聚甲醛溶液浸泡，于4 ℃冰箱中放置过夜以固定细胞，之后用PBS溶液缓慢清洗3次，再用混合有1%胎牛血清和0.2% Trition X-100的PBS溶液于室温下浸润90 min，以封闭样品；用鹅抗兔IgG-CY3抗体对封闭后的样品染色，于37 ℃环境下放置90 min；最后用PBS缓慢清洗后迅速置于荧光显微镜下观察，红色荧光的激发波段和发射波段分别为510~560 nm和>590 nm。
1.10 数据统计分析试验数据使用Excel 2013和SPSS 19.0软件处理，以均数±标准差表示。组间先进行方差分析，方差齐性用 t 检验，方差不齐用 t ′检验，P ＜0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果与分析 2.1 Caco-2细胞生长曲线(MTT法)通过MTT试验来表征不同材料的中空纤维反应器和Transwell单层培养模型中Caco-2细胞琥珀酸脱氢酶活性，即在570 nm处的吸光度值。如图 3所示，中空纤维反应器和Transwell单层模型呈现出相似的变化趋势( P >0.05)。在前9~10 d细胞的总琥珀酸脱氢酶活性不断增长，而在随后1周内总体上基本维持稳定水平，在细胞增长分化末期呈现出一定的衰减。其原因可能是在细胞大量增长融合后，由于生存空间有限而使细胞间形成了接触抑制，随后，其细胞内的大量营养物质和能量被用于功能分化，因而代表线粒体功能的琥珀酸脱氢酶有所减弱。
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| 图3 Caco-2细胞在Transwell插入式滤膜、PES和PVDF中空纤维膜上培养的MTT结果 Fig. 3 MTT value of Caco-2 cells cultured on the surface of Transwell insert,PES and PVDF hollow fibers |
在21 d培养周期内，Caco-2细胞在PES和PVDF中空纤维内表面的生长融合状态见图 4和图 5。在培养前期，Caco-2细胞增殖明显，逐渐形成细胞单层，覆盖了中空纤维膜内表面；而在培养后期，细胞数目明显增多，不仅覆盖膜材料表面，还出现复层生长，并出现部分球形死亡细胞。对2种中空纤维材料比较发现，在PES中空纤维膜表面，Caco-2细胞形态更为清晰，而在PVDF膜内培养21 d左右形成的细胞密度更大，完全覆盖了膜材料表面。
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| A~F分别表示接种Caco-2细胞后第2、5、7、9、11、19天的生长情况。标尺=1 mm。 A-F show the morphology of Caco-2 cell layers cultured on the inner surface of PES hollow fiber membrane at the days 2,5,7,9,11,19,respectively. Bar=1 mm. 图4 培养在PES中空纤维膜内表面的Caco-2细胞扫描电镜图 Fig. 4 Scanning electron microscope (SEM) images of the morphology of Caco-2 cell layers cultured on the inner surface of PES hollow fiber membrane |
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| A~F分别表示接种Caco-2细胞后第2、5、7、9、11、19天的生长情况。标尺=1 mm。 A-F show the morphology of Caco-2 cell layers cultured on the inner surface of PVDF hollow fiber membrane at the days 2,5,7,9,11,19，respectively. Bar=1 mm. 图5 培养在PVDF中空纤维膜内表面的Caco-2细胞扫描电镜图 Fig. 5 SEM images of the morphology of Caco-2 cell layers cultured on the inner surface of PVDF hollow fiber membrane |
从接种培养9 d的扫描电镜图(图 6)中可以观察到：Caco-2细胞在中空纤维膜表面黏附铺展良好，细胞均伸出伪足，细胞轮廓清晰，呈现出良好的梭形或不规则多边形的上皮细胞形态，逐渐汇合成片，形成细胞单层；在PVDF中空纤维膜上，部分细胞向材料空隙内迁移。
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| (A~B)：PES中空纤维，放大倍数分别为500×，2 000×；(C~D)：PVDF中空纤维，放大倍数分别为500×，2 000×。 (A-B): PES hollow fiber,with magnification times of 500× and 2 000× respectively; (C-D): PVDF hollow fiber,with magnification times of 500× and 2 000× respectively. 图6 Caco-2细胞在中空纤维上生长9 d后的扫描电镜图 Fig. 6 SEM images of the morphology of Caco-2 cells cultured on the inner surface of hollow fiber membranes at the ninth day |
使用Hoechst 33342染料对活细胞核进行原位荧光染色。从图 7和图 8中可以看出，在中空纤维膜内表面上可见大量染色的细胞核分布，有的细胞核呈椭圆形，有的呈梭形，贴附于中空纤维膜内侧。从细胞分布情况(图 7)看，在PES中空纤维内表面的Caco-2细胞分布相对不均匀，而在PVDF中空纤维内表面的细胞密度均匀。对比图 8和图 7可见，接种Caco-2细胞第8天后的中空纤 维内表面的细胞数较接种后第4天的增量明显，罕见浓缩、碎裂的细胞核。该结果与在扫描电镜下观察到的一致。
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| A：PES；B：PVDF。放大倍数200×。 A: PES; B: PVDF. The magnification is 200 times. 图7 接种Caco-2细胞第4天的中空纤维膜的荧光染色图 Fig. 7 Image of fluorescent staining of Caco-2 cells cultured on the inner surface of hollow fiber at the fourth day |
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| A：PES；B：PVDF。放大倍数200×。 A: PES; B: PVDF. The magnification is 200 times. 图8 接种Caco-2细胞第8天的中空纤维膜的荧光染色图 Fig. 8 Image of fluorescent staining of Caco-2 cells cultured on the inner surface of hollow fiber at the eighth day |
Caco-2细胞接种培养后，前期稳定增长融合形成细胞层，后期开始分化，出现肌动蛋白和刷状缘。刷状缘酶系中最具代表性的是碱性磷酸酶(ALP)和 γ -谷氨酰转肽酶( γ -GT)。碱性磷酸酶活性在Caco-2细胞培养周期中不断增长，可以验证单细胞层的分化情况[11]。本文在21 d的培养时间内通过测定特异性底物的水解反应速率来确定酶活性，对比PES、PVDF中空纤维膜和Transwell插入式滤膜之间的差别。如图 9所示：在PES和PVDF中空纤维膜上培养的Caco-2细胞的ALP活性在培养周期内持续快速增长，并在2周左右达到峰值，增长了约12倍，两者都与在Transwell上培养的结果存在显著差异；在培养8 d后，Caco-2细胞的ALP活性在PES和PVDF中空纤维反应器中的变化较为稳定，而在Transwell嵌套小室上培养的Caco-2细胞的酶活性增长缓慢，在培养10 d后较快增长，与酶活性已有下降的中空纤维膜上培养的细胞间差异有统计学意义( P ＜0.05)。
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| ALP活性值为相对于第1天活性值的倍数 The value of ALP activity is times of its activity cultured at day 1. 图9 培养在Transwell、PES和PVDF板上的Caco-2细胞的ALP活性检测 Fig. 9 Alkaline phosphatase (ALP) activity of Caco-2 cells cultured on the apical surface of Transwell insert and the inner surface of PES and PVDF hollow fiber membranes |
从图 10可以看出：在21 d的培养周期内，在中空纤维膜内表面培养的细胞的 γ -GT相对活性高于在Transwell嵌套小室上培养的细胞；在前期培养中，PES和PVDF中空纤维培养模型显著优于Transwell模型( P ＜0.05)，而三者在培养后期的酶活性水平趋于一致。
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| 图10 培养在Transwell、PES和PVDF板上的Caco-2细胞的 γ -GT活性检测 Fig. 10 γ -Glutamyltransferase ( γ -GT) activity of Caco-2 cells cultured on the apical surface of Transwell insert and the inner surface of PES and PVDF hollow fiber membranes |
完整的紧密连接网络是Caco-2细胞实现充分分化的标志之一。一般而言，用罗丹明-鬼笔环肽染色足以证明肌动蛋白细胞单层的存在，而ZO-1蛋白的免疫荧光染色结果可以验证Caco-2细胞紧密连接的完整性[2]。由于本试验采用的PVDF中空纤维膜的内表面孔径大于细胞直径，导致单个细胞生长于各膜孔内壁，荧光染色结果难以说明是否形成了细胞层表面紧密连接。而PES中空纤维膜表面相对光滑，从图 11中可以观察到具有完整紧密连接的Caco-2细胞层的形成。说明用本试验构建的PES中空纤维膜内表面培养Caco-2细胞可以保证细胞层的完整性和致密性。
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| 放大倍数200×. The magnification is 200 times. 图11 接种Caco-2细胞第10天的PES中空纤维膜内表面的ZO-1荧光染色图 Fig. 11 Image of ZO-1 fluorescent staining of Caco-2 cells cultured on the inner surface of PES hollow fiber membrane at the 10th day |
通常情况下，人们通过评价Caco-2细胞模型单细胞层的紧密性和完整性来判断模型构建是否成功，主要观测指标有细胞形态、刷状缘酶系活性、跨膜电阻值、漏出标志物被动扩散的跨膜通量等。只有至少满足2个以上条件才能说明Caco-2细胞单层的紧密性与完整性良好[12]。本试验采用多种显微镜观察细胞形态和测定刷状缘酶系活性，以及通过荧光染色观察来考察Caco-2细胞单层的完整性和细胞分化情况。
本文通过MTT法测定表明，细胞在前10 d快速增长，随后生长变缓趋于稳定，之后略有下降。这与文献[13]所报道的Caco-2细胞生长变化趋势一致。此外，Caco-2细胞在中空纤维膜内的生长情况与传统的Transwell单层细胞模型对比无显著差异。这与DENG等[14]的试验结果一致，证明该3维Caco-2模型不逊于传统的2维细胞模型。
从扫描电镜照片可以看出，在细胞培养后期，细胞逐渐融合形成单层结构，在PVDF中空纤维膜内甚至覆盖了膜内表面。在荧光显微镜下可以观察到被荧光染料染色的细胞核，从侧面反映了Caco-2细胞在中空纤维膜内表面生长情况良好，在培养周期的前期大量增殖并逐渐形成细胞单层。同时，ZO-1蛋白所指示的细胞间紧密连接的形成也证明了PES中空纤维膜构建的Caco-2细胞模型用于后期功能性成分渗透研究的可行性。
从Caco-2细胞的刷状缘酶系活性结果可知，在中空纤维膜反应器中的Caco-2细胞实现了充分的分化，其碱性磷酸酶和谷氨酰转肽酶活性均在8~14 d培养范围内达到较高水平，已经具备甚至高于在传统的Transwell插入式滤膜上培养21 d的细胞所具有的功能。
在体内，组织或器官需要星罗棋布的血管输送氧气和营养。而细胞体外培养时，由于缺乏网络状的血管系统，细胞聚集体超过一定厚度(一般为几百μm)就会导致位于中心的细胞缺乏营养和氧气而坏死，这是组织工程目前无法解决的难题[15-16]。尽管存在诸如培养环境不够均一、培养工艺不易放大的缺点，但具有微滤膜性质的中空纤维膜，不但直径大小可选，还能实现可控的选择透过性，是理想的组织和细胞体外培养的替代材料。中空纤维以它特有的优点，在加速细胞功能表达方面表现出极大的价值。
借助于现有的在药物渗透、转运、吸收方面的研究基础，近年来，Caco-2细胞模型也已经越来越多地被应用于食品科学领域中活性物质的吸收代谢研究[17]，如对类胡萝卜素[18]、酯类[19]、黄酮类物质[20]等的研究。未来除了在食品科学领域对活性物质的研究之外，构建Caco-2细胞中空纤维模型的成功经验，也可以运用到其他组织细胞模型的构建中，从而拓宽中空纤维细胞模型的应用范围。
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