中国中西医结合影像学杂志   2020, Vol. 18 Issue (5): 435-438
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引用本文
黄明明, 魏琳, 曹笑婉, 伏晓, 曾邦峰, 杨丽铭, 余晖, 刘静. 血管性认知障碍大鼠模型海马损伤的MRI表征[J]. 中国中西医结合影像学杂志, 2020, 18(5): 435-438. DOI: 10.3969/j.issn.1672-0512.2020.05.002
HUANG Mingming, WEI Lin, CAO Xiaowan, FU Xiao, ZENG Bangfeng, YANG Liming, YU Hui, LIU Jing. MRI findings of hippocampal injury in vascular cognitive impairment rat model[J]. Chinese Imaging Journal of Integrated Traditional and Western Medicine, 2020, 18(5): 435-438. DOI: 10.3969/j.issn.1672-0512.2020.05.002
血管性认知障碍大鼠模型海马损伤的MRI表征[PDF全文]
黄明明 , 魏琳 , 曹笑婉 , 伏晓 , 曾邦峰 , 杨丽铭 , 余晖 , 刘静
贵州医科大学附属医院放射科，贵州 贵阳 550008
收稿日期: 2020-07-28
基金项目: 贵州市科技局筑科合同项目资助（〔2017〕5-8）
通信作者: 刘静, E-mail:yangmoon_ok@163.com.
摘要：目的: 探讨血管性认知障碍（VCI）大鼠海马损伤的MRI表征，研究VCI进程中海马形态及代谢物的变化。方法: 采用改良Pulsinelli四血管闭塞（4-VO）法制作VCI大鼠模型，通过MRI结构像发现在认知障碍进程中大鼠海马形态的改变，以及使用LCModel软件定量分析海马中代谢产物的异常，并通过病理切片证实海马中存在的病理改变。结果: VCI大鼠术后3个月起海马体积明显萎缩；海马内存在代谢异常，表现为N-乙酰天门冬氨酸（NAA）/肌酸（Cr）降低和肌醇（MI）/Cr升高。结论: Pulsinelli 4-VO法可成功复制VCI大鼠模型，并引起海马形态及代谢物的异常；VCI大鼠海马NAA/Cr的早期降低和MI/Cr的早期升高具有早期诊断VCI的潜力。
关键词：脑血管障碍    认知障碍    磁共振成像    海马    早期诊断    
MRI findings of hippocampal injury in vascular cognitive impairment rat model
HUANG Mingming , WEI Lin , CAO Xiaowan , FU Xiao , ZENG Bangfeng , YANG Liming , YU Hui , LIU Jing
Department of Radiology, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang 550008, China
Abstract: Objective: To investigate the MRI features of hippocampal injury in vascular cognitive impairment (VCI) rats, and to study the changes of hippocampal morphology and metabolites in the process of VCI. Methods: Pulsinelli four vessel occlusion (4-VO) method was used to make the VCI rat model. The morphological changes of hippocampus in the process of cognitive impairment were found by MRI structural imaging, and the abnormal metabolites in hippocampus were quantitatively analyzed by LCModel software. The histochemical staining was performed to find the pathological changes in hippocampus. Results: The volume of hippocampus in VCI rats was significantly atrophied from 3 months after operation. Additionally, the metabolic abnormalities were found in the hippocampus of VCI rats, which manifested as the decrease of NAA/Cr and the increase of MI/Cr. Conclusions: The VCI rat model was successfully reproduced by Pulsinelli 4-VO method, and caused abnormal morphology and metabolites of hippocampus. The early decrease of NAA/Cr and the early increase of MI/Cr in hippocampus of VCI rats have the potential of early diagnosis of VCI.
Key words: Cerebrovascular disease    Cognitive impairment    Magnetic resonance imaging    Hippocampus    Early diagnosis    

血管性认知障碍(vascular cognitive impairment, VCI)是老年人群认知功能障碍最常见的2种类型疾病之一。脑血管病变是老年人及神经退行性病患者常见的隐匿性疾病, 被认为是引起认知功能障碍及痴呆的主要危险因素[1-2]。海马是公认的与认知功能密切相关的脑区, 临床研究[3-4]显示, VCI伴海马萎缩。但目前对VCI的早期诊断、有效治疗和预后评估一直是医学界面临的难题。动物模型的MRI研究作为连接疾病临床和基础研究的桥梁, 可帮助理解VCI进程中影像学指标与病理变化之间的联系, 将有助于更好地认识VCI的发生及发展。因此, 探讨VCI早期海马的影像学表现及VCI引起海马的病理改变具有重要的临床意义。本研究通过建立VCI的大鼠模型, 利用MRI并结合组织化学染色发现VCI引起海马损伤的MRI表征及其病理改变, 现报道如下。

1 材料与方法 1.1 VCI大鼠模型制作

将30只体质量约200 g的雄性SPF级大鼠[购买于贵州医科大学实验动物中心, 合格证编号:SYXK(黔)2018-0001]随机分为模型组20只和对照组10只, 采用改良的Pulsinelli四血管闭塞(4-VO)法模拟全脑慢性缺血。大鼠术前12 h禁食, 4 h禁水, 使用10%水合氯醛行腹腔注射麻醉(剂量300 mg/kg体质量)。手术第1天颈后正中切口, 分离出C1两侧翼孔, 用电凝针凝闭双侧椎动脉, 缝合; 24 h后于大鼠颈部正中切开, 钝性分离双侧颈总动脉, 并用血管夹夹闭10 min, 共3次, 每次间隔1 h。大鼠发生缺血性改变判断标准:夹闭双侧颈内动脉后, 皮肤黏膜变为白色, 眼球变白, 自主活动消失, 生命体征存在; 放开动脉夹行再灌注时, 皮肤黏膜及眼球逐渐变为红色, 大鼠可自主活动。对照组重复以上过程, 但不行血管处理。

1.2 仪器与方法 1.2.1 MRI扫描

所有大鼠于造模后2周、1个月、3个月、5个月行MRI扫描, 使用3.0 T人体扫描仪及小动物专用4通道相控阵表面线圈。使用10%水合氯醛对大鼠进行腹腔注射麻醉(剂量300 mg/kg体质量), 并将其头部固定于表面线圈。

T2WI解剖结构像, 扫描参数:TR 5 800 ms, TE 80 ms, 视野3.5 cm×3.5 cm, 采集矩阵256×128, 层厚1 mm, 层数20。

1H-MRS扫描采用单体素PRESS序列, 扫描参数:TR 2 000 ms, TE 40 ms, 采集矩阵128×128, 视野5 mm×8 mm×8 mm, 翻转角90°, 激励次数1, 扫描时长4 min 52 s。根据大鼠MRI轴位、冠状位、矢状位T2WI确定ROI, 即双侧海马, 尽量避开周围脑脊液等结构。ROI包含部分皮层及皮层下区域。

1.2.2 学习记忆能力检测

用Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能变化, 适应性喂养2周行预扫描。选择T2WI结构像上大脑实质无明显结构及信号异常的大鼠进行水迷宫实验, 主要包括定位航行和空间探索实验两部分。第1~5天完成定位航行实验, 方法:每日将大鼠按1、2、3、4象限顺序面向池壁从入水点放入水池中, 并记录60 s内大鼠找到固定于第4象限隐藏平台的时间(即逃避潜伏期)及游泳路径。每只大鼠每天训练4次, 以其4次逃避潜伏期的平均值作为当日的学习成绩; 第6天完成空间探索实验:撤去位于第4象限的平台, 将大鼠按同样方法放入水中, 记录其60 s内穿过第4象限原平台位置的次数及第1次穿过原平台位置的时间。

1.3 数据处理

在T2WI图像上手动画出代表海马面积的ROI(图 1), 读出像素个数。所有波谱原始数据导入电脑工作站, 应用LCModel软件进行处理, 主要包括N-乙酰天门冬氨酸(NAA)、肌酸(Cr)、肌醇(MI)、谷氨酸(Glu)的浓度。本研究采用NAA/Cr、MI/Cr、Glu/Cr比值的方法代表各代谢物的含量变化, 以消除个体差异。

图 1 左侧红色曲线勾画出选取海马的解剖位置  图 2 柱状图显示，从术后3个月起，海马出现萎缩[红色为对照组，绿色为血管性认知障碍（VCI）模型组]  图 3  ROI区（主要为海马大部分）1H-MRS定量分析统计图  图 3a  定位像红色方框显示的是1H-MRS波谱所采集的区域  图 3b  柱状图分别显示的是随VCI病程发展，NAA/Cr、Glu/Cr及MI/Cr（NAA，N-乙酰天门冬氨酸；Cr，肌酸；MI，肌醇）比值的变化  图 4  术后5个月VCI大鼠海马HE及Nissl染色图  图 4a（HE×100），4b（HE×200）海马CA1区锥体细胞排列紊乱、结构模糊，少数神经元呈点状或片状嗜伊红染色增强  图 4c（Nissl×100），4d（Nissl×200）显示海马锥体细胞胞浆内尼氏体减少、染色减弱，部分锥体细胞胞浆内尼氏体溶解、轮廓模糊着色浅淡

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析。水迷宫数据处理:实验数据以x±s表示, 模型组与对照组之间比较采用独立样本t检验, 模型组不同时间点的比较采用重复测量的方差分析, 使用Origin 7.0作图, 数据统计分析行两样本t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 水迷宫实验结果

模型组大鼠术后2周, 即出现学习和记忆能力下降, 与对照组大鼠相比, 其逃避潜伏期及第1次穿越平台时间延长, 穿越平台次数减少, 差异均有统计学意义(均P < 0.05)。术后1、3、5个月, 其学习记忆能力持续下降(表 1)。

表 1 Morris水迷宫检测大鼠学习记忆功能变化（x±s）

2.2 海马形态的变化

模型组大鼠2周、1个月海马面积大小与对照组大鼠相比, 差异均无统计学意义(均P > 0.05);但在术后3、5个月, 模型组大鼠海马体积明显萎缩, 与对照组大鼠相比, 差异均有统计学意义(均P < 0.05)(图 2)。

2.3 海马区域代谢产物的异常

对海马区域1H-MRS的定量分析, 发现模型组大鼠海马内存在代谢异常, 与对照组比较, 术后2周其NAA/Cr显著下降、MI/Cr显著升高, 一直持续至术后5个月; 此外, Glu/Cr在术后2周出现显著下降, 术后1个月下降至最低, 而后略有回升(图 3)。

2.4 海马区域HE及Nissl染色

海马CA1区锥体细胞排列紊乱、结构模糊, 少数神经元呈点状或片状嗜伊红染色增强, 似红色神经元。海马锥体细胞胞浆内尼氏体减少、染色减弱, 部分锥体细胞胞浆内尼氏体溶解、轮廓模糊着色浅淡(图 4)。

3 讨论

本实验采用改良Pulsinelli 4-VO法制作VCI大鼠模型, 水迷宫实验结果提示, 与对照组相比, VCI组在造模后2周即出现学习和记忆能力下降, 表现为逃避潜伏期及第1次穿越平台时间延长, 穿越平台次数减少, 证明VCI模型制作成功。VCI模型大鼠的学习和记忆能力随术后时间的延长, 损害加重, 说明此模型引起的全脑慢性缺血性改变可持续造成海马的损伤。

海马是公认的与认知功能密切相关的脑区, 临床实验[3-4]显示, VCI伴海马萎缩, 且两侧海马体积明显不对称, 左侧海马体积萎缩更明显。动物实验[5]也发现, VCI动物模型存在明显的海马损伤, 海马损伤可导致认知能力的受损, 且认知能力下降程度与海马组织受损的体积大小相关。本研究发现, 模型组大鼠2周、1个月海马体积大小与对照组相比, 差异均无统计学意义(均P > 0.05), 但在术后3、5个月, VCI模型组大鼠海马体积明显萎缩, 与对照组大鼠相比, 差异均有统计学意义(均P < 0.05), 提示海马组织损伤明显; 且随时间延长, 损伤加重, 认知能力下降越明显。

1H-MRS是目前检测脑内代谢物和生化成分的唯一非侵袭性技术, 具有很好的可重复性及稳定性, 它可提供神经元的功能、活力、完整性、能量代谢及神经胶质增生等信息[6]。据报道[7], VCI患者NAA、NAA/Cr水平降低, 卒中后无认知障碍的患者无神经代谢的改变, 但伴认知功能障碍者顶、枕叶NAA水平显著降低[8]。MI仅存在于胶质细胞中, 其功能和维持神经胶质细胞的体积稳定有关, 升高则提示胶质增生[9]。既往研究[7]显示, 双侧海马MI的升高与认知损害程度呈正相关, 说明认知损害随海马区神经胶质细胞增生的程度加深而不断加重。在阿尔茨海默病研究[10-11]中发现, 轻度认知障碍患者海马MI/Cr值显著增加, 且其敏感程度高于NAA的降低。本研究也发现, 与对照组比较, VCI模型组大鼠MI/Cr升高, 术后1、3、5个月大鼠海马MI/Cr较术后2周升高, 表明VCI模型组大鼠海马早期即出现神经胶质细胞的增生。

综上所述, VCI大鼠在术后2周即出现海马代谢物的异常, 主要为NAA含量的持续降低及MI含量的持续上升, 而在术后3个月, 海马才表现出明显萎缩。因此, 推测VCI大鼠海马内代谢物的改变可能早于海马形态的改变, VCI大鼠海马NAA浓度的早期降低和MI浓度的早期升高可能成为VCI早期诊断的观察指标。

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