2. 福建医科大学福建省天然药物药理学重点实验室, 福建 福州 350122
2. Fujian Key Laboratory of Natural Medicine Pharmacology, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China
在社会经济持续发展的进程中，癌症已成为危及人类身体健康的关键因素之一。肺癌的发病率与死亡率增长态势迅猛，在各类恶性肿瘤里，其对公众健康及生命安全构成的威胁尤为突出。2022年，肺癌在全球所有癌症中，无论是发病人数还是死亡人数，均高居榜首，这清晰地反映出肺癌在全球范围内所带来的沉重疾病负担。肺癌在我国癌症发病谱与死因谱中均位列首位，其发病数占我国癌症发病总数的22.0%，死亡数占我国癌症死亡总数的28.5%。从全球视角来看，我国肺癌发病数量在全球肺癌发病总数中占比高达42.8%，死亡人数占全球肺癌死亡总数的40.3%，由此可见，肺癌在我国造成的疾病负担极为沉重[1]。肺癌的分类，按照不同的标准，可以分为不同的类型，从病理组织学角度，可以分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。化疗、靶向治疗、免疫治疗等是目前治疗癌症的主要辅助手段。
姜黄素是从姜黄中提取的一类多酚类化合物，近年来吸引了国内外众多科研人员的关注。大量研究指出，姜黄素对多种癌细胞展现出明显的抑制活性，在抗肿瘤领域极具潜力。但姜黄素有其自身的缺陷，姜黄素光稳定性欠佳、水溶性不高、光敏活性极易受环境因素干扰，并且生物利用度较低，这些问题严重阻碍了姜黄素在临床上的广泛应用[2]。为解决这些问题，借助化学修饰与结构改造的方式来研发姜黄素衍生物，已然成为当下的研究热门方向。实验室通过对姜黄素进行化学结构修饰，成功制备出一系列姜黄素衍生物[3-5]，并对其进行了全面表征，旨在提高该化合物的水溶性、光稳定性以及光敏活性。在前期的研究中，发现C0818(Fig 1)，3，5-(E)-双(3-甲氧基-4-羟基亚苄基)-4-哌啶酮盐酸盐通过与热休克蛋白90(heat shock protein 90，HSP90)的C端二聚化结构域结合，并抑制其ATP酶活性，进而抑制HSP90的功能[5]。许多癌基因产物蛋白都是HSP90的客户蛋白，需要与HSP90分子伴侣复合物结合才能形成成熟的构象，获得足够的稳定性与活性，参与肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、抗凋亡等重要过程。C0818是一种有效的HSP90抑制剂[5]，因此，本文研究姜黄素衍生物C0818对NSCLC细胞迁移、凋亡及增殖的影响，探讨其抗NSCLC的可能作用机制。
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| Fig 1 Structure of C0818 (molecular weight 400) |
人NSCLC细胞株NCI-H1299、NCI-H460，由福建省天然药物药理学重点实验室冻存。NCI-H1299和NCI-H460培养于含10%胎牛血清、青霉素100 kU·L-1、链霉素100 mg·L-1的RPMI 1640培养液中。置37 ℃、5% CO2饱和湿度培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。
1.2 药物与试剂姜黄素衍生物C0818由本实验室合成，经HPLC及薄层层析分析鉴定，纯度为95%以上。称取适量的C0818粉末，溶解于DMSO中，使得终浓度为100 mmol·L-1，-20 ℃避光保存，临用解冻，按所需浓度稀释。MTT、碘化丙啶(propidium iodide，PI)，购自Sigma公司；羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(hydroxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE)染料，购自日本Dojindo公司；细胞凋亡检测试剂盒，购自Roche公司；四甲基罗丹明乙酯高氯酸盐(tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate，TMRE)，购自Abcam公司；M36008 MitoSOXTM，购自美国Invitrogen公司；一抗caspase-3(货号：9664S)、cleaved caspase-3(货号：9664T)、多腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly(ADP-ribose) polymerase，PARP](货号：9542T)、cleaved PARP(货号：5625T)、β-actin(货号：4967S)、Bcl-2(货号：2870S)、Bax(货号：2772S)、caspase-8(货号：4790)、cleaved caspase-8(货号：9496)、GAPDH(货号：2118)，均购自美国Cell Signal Technology公司；抗体N-cadherin(货号：ab76011)、β-catenin(货号：ab224803)、Vimentin(货号：ab217673)，均购自英国Abcam公司。
1.3 仪器Varioskan Flash酶标仪(美国Thermo Scientific公司)；FACSCantoII流式细胞仪(美国BD公司)；免疫印迹成像系统(Carestream公司)；稳压稳流电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
2 方法 2.1 MTT法测定肺癌细胞NCI-H1299和NCI-H460的活性取对数生长期的细胞接种96孔板(终浓度1×107·L-1)，在存在或不存在C0818的条件下，37 ℃孵育24、48、72 h，重复3次。使用MTT染色法测定细胞活性，C0818对细胞生长的抑制作用以IC50值表示。
2.2 CFSE染色法测定肺癌细胞NCI-H1299和NCI-H460增殖能力将对数生长的细胞在37 ℃的CFSE染色溶液中重悬10 min，用含10% FBS的冷RPMI 1640培养基洗涤后，将细胞在12孔板中以1×107 ·L-1的终浓度，在存在或不存在C0818的情况下，37 ℃下生长72 h。将细胞重悬于PBS中，通过流式细胞术进行分析。
2.3 PI染色检测细胞周期药物处理24 h后，将细胞重悬于PBS中，缓慢加入预冷的70% 乙醇，置于-20 ℃冰箱固定过夜，用冷PBS洗涤后，将细胞与含RNase A和PI的染色缓冲液在37 ℃下孵育30 min，然后通过流式细胞仪分析。
2.4 细胞凋亡检测药物处理48 h后，将细胞重悬于100 μL含有Annexin-V-APC/PI的HEPES缓冲液中。在室温避光孵育15 min后，使用流式细胞仪分析。Annexin-V与细胞膜外层表达磷脂酰丝氨酸的细胞结合，Annexin-V染色阳性的细胞被标记为凋亡细胞[4]。
2.5 TMRE线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)测定药物处理24 h后，将细胞重悬于含TMRE的PBS/0.2%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)中，室温避光孵育10 min。孵育后，通过流式细胞仪在Ex/Em=549/575 nm下分析细胞。
2.6 检测线粒体活性氧(reactive oxygen species，ROS)将细胞接种在12孔板中，并在37 ℃、5% CO2培养箱中培养过夜。药物处理48 h后，将细胞重悬于300 μL含有MitoSOXTM试剂的1% BSA的DPBS染色溶液中，并立即进行流式分析。
2.7 细胞划痕实验记号笔在24孔板背后，每孔画3条线，线条间隔0.5~1 cm，定位6个拍照点。取对数生长期的NCI-H1299和NCI-H460细胞接种，每孔细胞数2×105个；d 2用10 μL枪头比着直尺，垂直于Marker线划痕；PBS洗3次，加含不同浓度药物的RPMI 1640培养液(2%~5% FBS)，放入37 ℃、5% CO2培养箱培养，分别于培养0、24、48 h拍照记录划痕宽度[6]。迁移率＝(0 h划痕宽度-24 h或48 h划痕宽度)/0 h划痕宽度×100%。
2.8 Transwell小室迁移实验在下室内加入600 μL含20% FBS的RPMI 1640培养液。取对数生长期的NCI-H1299和NCI-H460细胞，用含0.2% BSA的RPMI 1640培养液重悬细胞，调整细胞浓度为2.5×108~5×108·L-1；按每孔180 μL加入Transwell上室内，加入20 μL不同浓度的药物，放置于37 ℃、5% CO2培养箱，12~24 h后，将小室滤膜上层的未迁移细胞用棉签轻轻擦去，PBS洗涤，以甲醇固定15~20 min；待滤膜干后，用0.1%草酸铵-结晶紫染液染色15~20 min，用棉签轻轻擦去结晶紫染液，PBS洗，放置风干；小室于显微镜下观察，拍照，计数[6]。迁移抑制率=(1-实验组平均迁移细胞数/对照组平均迁移细胞数)×100%。
2.9 蛋白免疫印迹法检测线粒体凋亡、细胞迁移相关蛋白的表达采用SDS-PAGE凝胶电泳对蛋白提取物进行分离。电泳后，将蛋白质转移到PVDF膜(200 mA，4 ℃)1~2 h。将膜在室温下封闭1 h，然后与相关抗体在4 ℃下孵育过夜。与二抗孵育2 h，并通过Carestream图像站系统，用ECL底物显影。
2.10 统计学方法采用GraphPad Prism软件和Origin8.6软件进行统计学分析。数据采用x±s表示；多组间比较采用One-Way analysis of variance分析。检验水准α=0.05。
3 结果 3.1 姜黄素衍生物C0818对NCI-H1299和NCI-H460细胞活性和增殖的抑制作用为了确定C0818对细胞活性和增殖的影响，分别采用MTT法和CFSE染色法检测。Fig 2A结果显示，随着药物浓度的递增及作用时间的延长，C0818对细胞的抑制率不断上升，呈现出剂量相关性与时间相关性。C0818处理NCI-H1299细胞24、48、72 h后，IC50值分别为(1.62±0.10)、(0.73±0.02)、(0.67±0.03)μmol·L-1；C0818处理NCI-H460细胞24、48、72 h后，IC50值分别为(1.42±0.10)、(0.69±0.04)、(0.58±0.04)μmol·L-1。Fig 2B CFSE染色测定显示了C0818对NCI-H1299和NCI-H460细胞增殖的剂量依赖性抑制。表明C0818抑制NCI-H1299和NCI-H460细胞的增殖。
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| Fig 2 C0818 inhibited proliferation of NSCLC cells (x±s, n=3) A: NCI-H1299 and NCI-H460 cells were treated with C0818 (0-8 μmol·L-1) for 24, 48, 72 h, and subjected to MTT assay; B: NCI-H1299 and NCI-H460 cells were stained with CFSE and then were treated with C0818 at the indicated concentrations for 72 h, harvested and subsequently analyzed by flow cytometry. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
为进一步了解C0818对细胞周期的影响，采用PI染色法，观察了C0818对细胞周期分布的影响。结果显示(Fig 3)，与对照组相比，C0818处理细胞24 h，导致G2/M期细胞群的增加，伴随着G0/G1期和S期细胞的减少。结果表明，C0818有效地诱导NCI-H1299和NCI-H460细胞的细胞周期阻滞于G2/M期。
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| Fig 3 C0818 induced G2/M phase cell cycle arrest in NCI-H1299 (A) and NCI-H460 (B) cells (x±s, n=3) **P < 0.01 vs Control group. |
为了确定C0818对NCI-H1299和NCI-H460细胞活力的抑制是否与诱导细胞凋亡有关，使用Annexin-V-APC/PI染色，并量化C0818诱导NCI-H1299和NCI-H460细胞凋亡的数量。结果显示(Fig 4)，C0818以浓度依赖性方式诱导NCI-H1299和NCI-H460细胞凋亡。
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| Fig 4 Effect of C0818 on apoptosis of NCI-H1299 (A) and NCI-H460 (B) cells (x±s, n=3) *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
TMRE用于标记活性线粒体。TMRE是一种细胞渗透性、带正电荷的橙红色染料，易在带相对负电荷的活性线粒体中积累。去极化或失活的MMP降低，无法蓄积TMRE。采用TMRE染色验证C0818对细胞MMP的影响，结果显示(Fig 5A)，C0818处理细胞导致MMP明显降低，表明C0818破坏NSCLC细胞线粒体膜的完整性，引起MMP下降。
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| Fig 5 C0818 triggered mitochondrial pathway of apoptosis and induced ROS aggregation in NSCLC cells (x±s, n=3) A: Treatment of NCI-H1299 or NCI-H460 cells with C0818 at the indicated concentrations for 24 h significantly reduced the MMP as demonstrated by TMRE staining; B: Flow cytometry was employed to quantify mitochondrial ROS levels in cells; C: After NSCLC cells were treated with C0818 for 48 h, mitochondria-related apoptotic proteins were measured by Western blot. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
为了研究C0818的抗肿瘤活性是否来源于ROS的激活，应用MitoSOX检测线粒体ROS的水平。结果显示(Fig 5B)，与未处理的对照组相比，用不同浓度的C0818处理NCI-H1299和NCI-H460细胞48 h后，线粒体ROS水平随药物浓度增加而升高，表明C0818的抗肿瘤活性来源于ROS的激活。
为了研究细胞凋亡的途径，采用Western blot检测凋亡相关蛋白。结果显示(Fig 5C)，C0818作用于细胞后，促凋亡蛋白Bax、cleaved PARP、cleaved caspase-3/8上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调。表明C0818可以通过外源性和内源性两条途径来促进肺癌细胞的凋亡。
3.4 C0818对NCI-H1299和NCI-H460细胞迁移能力的影响为了进一步了解C0818对细胞迁移能力的影响，分别采用划痕实验、Transwell小室技术和Western blot检测。Fig 6A划痕实验结果显示，随着C0818作用时间和剂量的增加，NCI-H1299和NCI-H460相对迁移抑制率增加，表明C0818对NSCLC细胞运动迁移能力的抑制作用明显。Transwell小室迁移实验结果如Fig 6B所示，随着C0818浓度增加，迁移穿过小室的细胞数目明显减少，表明C0818具有很好的抑制NSCLC细胞迁移的能力。Fig 6C的Western blot实验结果显示，与对照组相比，随着C0818浓度的增加，侵袭转移标志蛋白N-cadherin、β-catenin、Vimentin的表达量均出现下降，表明C0818可能通过β-catenin相关信号通路影响NSCLC细胞的迁移。
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| Fig 6 Effects of C0818 on migration ability of NCI-H1299 and NCI-H460 cells (x±s, n=3) A: C0818 inhibited the movement of NSCLC cells; B: C0818 inhibited the invasion of NSCLC cells; C: C0818 inhibited the expression of proteins related to metastasis of NSCLC cells. *P < 0.05, **P < 0.01 vs Control group. |
肺癌治疗领域的研究热点以及潜在靶点，聚焦于肿瘤细胞所特有的特异性分子标志物，或是与之紧密关联的重要信号通路[7]。目前，已有大量针对相关信号通路的分子靶向药物，如吉非替尼、紫杉醇等化疗药物。然而，肺癌药物治疗的整体有效率依旧处于较低水平，不同患者对这些抗肿瘤药物的敏感程度大不相同。并且，在治疗期间，患者还很容易产生药物耐受现象。鉴于此，深入探究肺癌药物治疗过程中涉及的分子机制，开拓全新的治疗方法，或是探寻提升药物敏感性的途径，都具有极其重要的意义[8]。C0818对肺癌细胞NCI-H1299和NCI-H460均表现出较强的杀伤作用。在MTT结果中，C0818以剂量和时间依赖的方式抑制NCI-H1299和NCI-H460细胞的活性，CFSE染色实验进一步证实了C0818对NCI-H1299和NCI-H460细胞具有抗增殖作用。C0818可诱导NCI-H1299和NCI-H460细胞的细胞周期停滞在G2/M期，这在一定程度上解释了所观察到的C0818对细胞增殖的抑制作用。
细胞凋亡作为一种程序性细胞死亡现象，主要受两条关键途径调节：一是内源性途径，该途径主要由线粒体介导，故也称作线粒体途径；另一条是外源性途径，因起始于细胞表面死亡受体与相应配体的结合，所以也称为死亡受体途径[9]。MMP是线粒体功能的一个重要参数，被用作细胞活性的指标。MMP与线粒体的许多功能作用高度相关。MMP控制ATP合成、ROS的产生、线粒体钙螯合、蛋白质进入线粒体和线粒体膜动力学。反过来，MMP受ATP利用、线粒体质子传导、呼吸链功率和线粒体钙的控制。因此，MMP的药理学变化可能与多种线粒体病理参数有关。ROS主要来源于线粒体，并且线粒体是ROS诱导损伤的主要部位[10]。大量ROS的存在会氧化腺嘌呤核苷酸转位酶的巯基，导致线粒体通透性转换孔过度开放，进而使线粒体膜的通透性增加，MMP降低[11]。线粒体凋亡途径受Bcl-2家族蛋白的调控。Bcl-2家族蛋白包含两类功能相反的蛋白：一类是抗凋亡蛋白，其中具有代表性的有Bcl-2和Bcl-xL，它们能够有效抑制细胞凋亡进程，维持细胞的存活状态；另一类则是促凋亡蛋白，如Bax和Bad，一旦被激活，便积极推动细胞走向凋亡，促使细胞启动程序性死亡机制[12]。C0818诱导了ROS的产生及caspase的激活，在这一过程中，促凋亡因子Bax上调，抗凋亡因子Bcl-2下调，Bax/Bcl-2比例上调，二者比例的变化推动了线粒体功能紊乱的进程。线粒体功能一旦出现障碍，便会致使MMP下降，同时线粒体的通透性明显增加。MMP的减少促进细胞色素c的释放，细胞色素c反过来使得内源性线粒体介导的凋亡蛋白caspase(半胱氨酸蛋白酶)被激活，激活后的caspase促进下游底物PARP剪切体增加，抑制受损DNA的修复而诱导凋亡，Bax/ Bcl-2比例上调，促进了caspase等的释放，细胞通过cleaved caspase-3执行细胞凋亡[13-14]，而在外源性细胞凋亡途径中，caspase-8首先被激活，从而引发后续的下游级联反应。C0818处理细胞后，导致caspase-8被激活。提示C0818可以通过外源性和内源性两条途径来促进肺癌细胞的凋亡。
肺癌转移是肺癌晚期常见的现象，会对患者的预后产生重要影响。当肿瘤细胞发生侵袭转移时，其蛋白表达情况会出现明显变化。上皮样标志物E-cadherin的蛋白表达水平会明显降低，而间质细胞标志物，例如N-cadherin、Vimentin等的蛋白表达量呈上升趋势[15]。β-catenin作为一种结构衔接蛋白，将钙黏蛋白与肌动蛋白细胞骨架连接起来，有助于维持细胞间的黏附连接，保证组织的完整性和稳定性，是经典Wnt信号通路的关键效应分子。当Wnt信号通路被激活，细胞质中β-catenin开始大量累积。随后，这些积聚的β-catenin会进入细胞核内，与转录因子TCF/LEF相互结合，进而激活c-Myc、cyclin D1等原癌基因，从而会对细胞的增殖、分化及侵袭转移等关键过程产生影响[16-17]。在肿瘤细胞中，N-cadherin的表达变化可影响肿瘤细胞的侵袭和转移能力，其异常表达与肿瘤细胞从原发部位脱离并发生远处转移密切相关。N-cadherin可与细胞内的信号分子相互作用，参与细胞内信号转导通路，调节细胞的生存、增殖和分化等过程。例如，它可以与β-catenin结合，间接影响Wnt信号通路的活性。此外，Vimentin还可以与其他细胞骨架成分及信号分子相互作用，调节细胞的迁移和侵袭相关信号通路。C0818下调侵袭转移标志蛋白N-cadherin、β-catenin、Vimentin的表达，提示C0818影响肺癌的转移可能与β-catenin通路有关。
综上所述，C0818将细胞阻滞于G2/M期，抑制肺癌细胞的增殖，通过影响β-catenin相关通路抑制细胞迁移。此外，C0818通过线粒体途径诱导细胞凋亡，在这一过程中，MMP的下降和ROS的过量产生起着重要作用。本研究结果为进一步将C0818开发为一种有前景的治疗肺癌的药物提供了基础数据。
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