2. 甘肃省靖远县畜牧兽医技术服务中心，甘肃 靖远 730600
2. Animal Husbandry and Veterinary Technical Service Center, Jingyuan, Gansu 730600, China
腹泻是以排便频率增加，腹痛不安，排出黏脓性粪便，甚至泻出如水样为主症的病证。腹泻的病变部位主要在胃肠，主要病机为脾虚湿盛[1]，发病原因主要包括外感湿邪、内伤饮食、脾胃虚弱，命门火衰等。近年来，腹泻发病率不断上升，多种致病因素共同侵入机体，阴阳错杂难以根治，因此对腹泻的治疗需求日益迫切。现代医学主要从止泻、解痉、抗菌抑菌、调节肠道菌群、抗抑郁等方面进行治疗[1]，但总体疗效不佳，复发率较高且难以根治，长期应用部分药物可能导致胃肠道毒副作用，且易引发肝肾损伤。
中医药治疗腹泻相关疾病疗效确切，能通过多成分、多环节、多途径等作用缓解患者的临床症状和肠道损伤[2-8]。理中汤由干姜、白术、党参、炙甘草组成，具有健脾益气、理中散寒，临床主要用于寒湿泄泻等，现代药理学研究表明，理中汤对腹泻、急性胃肠炎、结肠炎等多种消化系统疾病具有显著疗效[9-10]，但是理中汤发挥治疗寒湿泄泻的作用机制，包括潜在的治疗靶点，生物代谢过程以及代谢途径的分析都缺乏系统的研究。本研究采用网络药理学和分子对接的方法，对理中汤治疗寒湿泄泻的主要活性成分、潜在靶点和信号通路进行预测，为理中汤治疗寒湿泄泻的作用机制研究提供基础。
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器阳离子洗涤剂十二烷基硫酸钠(S8010)，四甲基乙二胺(T8090)，分离胶缓冲液(S1051)，浓缩胶缓冲液(S1052)，吐温20(T8220)；Protein Marker Ⅳ(8-200 ku)(G2083)，购自武汉塞维尔生物科技有限公司；TJP1 Rabbit pAb(bs-1329R)，购自北京博奥森生物技术有限公司；Beta Actin(20536-1-AP)、Occludin(13409-1-AP)、E-cadherin(20874-1-AP)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG H+L(SA00001-3)，购自武汉三鹰生物技术有限公司；硝酸纤维素转印膜(BS-PVDF-22)，深圳兰杰柯科技有限公司；RM2235切片机，德国Leica公司，OlympusDP-71，日本Olympus公司。IL-6(ml102828)、IL-10(ml002813)、TNF-α(ml002859)、IL-1β(ml037361)ELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。超微量ATP酶测试盒(Na+-K+、Ca2+-Mg2+-ATP酶)(A070-6-2)生化试剂盒购自南京建成生物工程研究所有限公司。
1.2 网络药理学方法 1.2.1 理中汤活性成分的筛选及靶点的构建干姜(Ganjiang，GJ)、白术(Baizhu，BZ)、党参(Dangshen，DS)和甘草(Gancao，GC)的化合物数据获取自Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP：https://tcmsp-e.com/)和TCM数据库@Taiwan[TCMID：TCM-ID (bidd.group)]。并结合相关文献研究进行成分和靶点的补充。筛选条件：(1)口服生物利用度(OB)值≥30%(2)药物相似性(DL)值≥0.18。使用TCMSP“相关靶点”模块搜索理中汤中活性化合物的靶点合并四味中药的有效成分。
1.2.2 腹泻相关疾病靶点的构建从GeneCards数据库(http://www.genecards.org/)、OMIM数据库(https://omim.org/)、ChEMBL数据库(https://www.ebi.ac.uk/chembl/)、HPO数据库(https://hpo.jax.org/app/)和药物靶点数据库DrugBank(https://go.drugbank.com/)，5个数据库中使用“diarrhoea”作为关键词检索，获得腹泻疾病靶点剔除重复靶点后，即建立了腹泻的靶点库。
1.2.3 药物疾病共有靶点的筛选与蛋白相互作用(PPI)网络的构建将腹泻靶点与理中汤活性成分共同靶点，并使用Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.htmL)进行可视化，得到理中汤治疗腹泻疾病靶点。使用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)构建PPI网络并将结果其导入Cytoscape3.8.0(https://cytoscape.org/)软件构建潜在关键靶点网络并计算Degree值。
1.2.4 网络构建使用Cytoscape 3.8.0软件构建“中药-活性成分-靶点”网络。根据Degree值大小进行排名，筛选出排名前3(改成前3名)的药物主要活性成分。
1.2.5 GO和KEGG富集分析使用DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO和KEGG通路富集分析，利用微生信(https://www.bioinformatics.com.cn/)进行可视化。
1.2.6 分子对接使用AutoDockTools1.5.6和AutoDockVina4.2将前10个关键化合物合并四味中药的有效成分(Tab 2)，并与Degree值前3的核心靶点蛋白进行分子对接验证。从PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库下载活性成分的3D结构；利用PDB数据库下载关键蛋白，在AutoDockTools1.5.6中实现分子对接并计算结合能。最后运用GraphPad Prism 8进行热图分析，使用PyMOL和DiscoveryStudio2020进行可视化。
1.3 实验验证 1.3.1 动物实验SPF级雄性SD大鼠，(200±5) g，购自兰州兽医研究所实验动物中心，许可证批准号：SCXX(甘)2015-0001，饲养于室温，温度(25±2) ℃，湿度40%~50%，光照/黑暗12 h交替适应性饲养7 d。动物福利和实验程序符合《实验动物管理和使用指南》，并获得甘肃农业大学动物伦理委员会和动物管理机构的批准(许可证批准编号：GAU-LC-2020-003)。
48只SD大鼠随机分为4组，正常对照组(K)、低温高湿模型组(DG)、理中汤治疗组(LZDG)、白头翁汤治疗组(BTDG)，每组12只，先进行3 d的适应性饲养。根据陈宝霞等[7]的造模方法，并结合课题组之前的研究，制备寒湿泄泻大鼠模型(见中国知网本文增强出版附加材料1)。
造模期间每天早上8：00测量体温、体质量、采食量和饮水量。其中，K组自由饮用蒸馏水，其余各组每天自由饮用冰水混合物(0 ℃)。K组仍在前述室温条件下饲养，DG组、LZDG组和BTDG组大鼠置于温度(4±2) ℃、湿度(90±5)%环境中饲养，8 h·d-1，共9 d。从d 4晚开始灌胃，K组灌胃生理盐水，DG组、LZDG组和BTDG组灌胃番泻叶(10 g·kg-1，1次/日)；次日上午，K组和DG组灌胃生理盐水，LZDG组灌胃理中汤(4.375 g·kg-1，1次/日)，BTDG组灌胃白头翁汤(3.76 g·kg-1，1次/日)，连续灌胃6 d。上述造模方法改进自陈宝霞等[7]利用寒冷潮湿环境+番泻叶来造成寒湿泄泻的动物模型。理中汤(4.375 g·kg-1，1次/日)和白头翁汤(3.76 g·kg-1，1次/日)的药物浓度均来自前期实验结果，d 10下午，麻醉大鼠后腹主动脉采血处死大鼠，采集血液样本制备血清，取回肠和结肠固定于10%中性福尔马林中，剩余回肠、结肠和血清均冻存于-80 ℃条件下。
1.3.2 药物及其制备番泻叶、白头翁、黄连、黄柏、秦皮、党参、干姜、白术、炙甘草，甘肃省兰州市黄河药材批发市场产品经甘肃农业大学动物医学院中兽医教研室魏彦明教授鉴定。
番泻叶、理中汤和白头翁汤水提物的提取参照课题组前期的提取方法陈宝霞等[11]。
1.3.3 诊断标准寒湿泄泻参照《中医病证诊疗标准与方剂选用》中的寒湿困脾证相关标准：大便清稀或如水样，次数增多，腹痛肠鸣，畏寒食少，并伴腹胀腹痛等症。并符合中华人民共和国中医药行业标准《中医内科病证诊断疗效标准》(ZY/T001.1-94)[12]中辨证分型为寒湿型泄泻的诊断标准。
1.3.4 大鼠腹泻程度的评定 1.3.4.1 稀便率的测定稀便率=稀便数目/粪便总数×100%
1.3.4.2 稀便级与平均稀便级稀便级根据被粪便污染的滤纸直径分为4个等级：
| Water trail diameter | Stool rating |
| < 1 cm | Level 1 |
| 1-1.9 cm | Level 2 |
| 2-3 cm | Level 3 |
| >3 cm | Level 4 |
平均稀便级＝所有稀便级数之和/稀便次数
1.3.4.3 腹泻指数腹泻指数＝稀便率×平均稀便级
1.3.4.4 粪便含水量的测定粪便含水量被用来评价腹泻的一个验证指标。在d 1、3、5、7、9采集粪便并称质量(M1)，在120 ℃条件下干燥12 h后再次称质量(M2)。
粪便含水量=[干燥前质量(M1)-干燥后质量(M2)]/干燥前质量(M1)×100%
1.3.5 ATP酶检测严格按照试剂盒说明书检测血清ATP酶活性水平。
1.3.6 组织学分析将大鼠回肠和结肠保存在10%中性福尔马林中两周，制作石蜡切片用于苏木精-伊红染色(HE)。截取大鼠中段结肠、回肠组织各0.5 cm，常规固定、脱水、包埋、切片、烤片、染色、封片。于40倍镜下观察全部组织，选择特征性明显的区域采集200倍镜下图片，详细观察并描述。
1.3.7 酶联免疫吸附试验严格按照ELISA试剂盒说明书检测每种炎性因子，IL-6、IL-10、TNF-α、IL-1β。
1.3.8 Western blot称取大鼠结肠组织，按1 mg组织：10 μL高效裂解液的比例加入裂解液，用10%SDS-PAGE分离蛋白，BCA法测定细胞总蛋白浓度。分离(浓缩胶电压80 V；分离胶电压120 V)。将分离后的蛋白电转移至PVDF膜。7%脱脂奶粉封闭2 h，一抗β-actin(1 ∶5 000)、E-cadherin(1 ∶3 000)、Occludin(1 ∶5 000)、ZO-1(1 ∶5 000)和MMP9(1 ∶1 000)，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤，二抗以1 ∶7 000稀释，室温孵育1 h，TBST洗涤，之后加入ECL化学发光液，AmershamImager 600化学发光仪进行信号采集并拍照，ImageJ软件对每组图片进行灰度值分析。
1.4 统计方法使用SPSS 27.0软件进行分析。使用Origin 2022软件以及GraphPad Prism 8绘图。结果以x±s表示，组间比较进行单因素差分析(ANOVA)检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 活性成分筛选及潜在作用靶点根据TCMID和TCMSP数据库的检索结果筛选后共获得125个活性成分，其中干姜(GJ)5种，白术(BZ)7种，党参(DS)21种，甘草(GC)92种(附件2)。筛选得到了60种化合物。通过检索TCMSP靶点模块，得到2 060个活性成分的潜在靶点以及对应的基因符号。“中药-化合物-靶点网络”(附件3)。该网络展示了理中汤活性成分与腹泻靶点的复杂联系。
网络分析结果表明，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚、β-谷甾醇、柚皮素、芹糖甘草苷、黄豆素、白术内酯Ⅰ、白术内酯Ⅱ、白术内酯Ⅲ、木樨草素等为理中汤活性成分(Tab 2)。
| PubChem CID | Active compounds | Source |
| 34756 | 6-gingerol | Dried Ginger |
| 168114 | 8-gingerol | Dried Ginger |
| 168115 | 10-gingerol | Dried Ginger |
| 222284 | beta-sitosterol | Dried Ginger |
| 439246 | naringenin | Liquorice root |
| 10076238 | Liquiritin apioside | Liquorice root |
| 503737 | Liquiritin | Liquorice root |
| 6442433 | Isoliquiritin apioside | Liquorice root |
| 5318591 | Isoliquiritoside | Liquorice root |
| 5318998 | licochalcone a | Liquorice root |
| 5281654 | isorhamnetin | Liquorice root |
| 5317480 | Lupiwighteone | Liquorice root |
| 5280378 | formononetin | Liquorice root |
| 5280448 | Calycosin | Liquorice root |
| 480784 | glyasperin B | Liquorice root |
| 392442 | glyasperin F | Liquorice root |
| 911486 | 7-Methoxy-2-methyl isoflavone | Tangshen、Liquorice root |
| 14135589 | tangshenoside Ⅰ | Tangshen |
| 5316860 | syringin | Tangshen |
| 441965 | Frutinone A | Tangshen |
| 5317750 | glycitein | Tangshen |
| 5321018 | Atractylenolide Ⅰ | Largehead Atractylodes Rh |
| 14448070 | Atractylenolide Ⅱ | Largehead Atractylodes Rh |
| 155948 | Atractylenolide Ⅲ | Largehead Atractylodes Rh |
| 5280445 | luteolin | Largehead Atractylodes Rh |
通过对GeneCards、OMIM、ChEMBL、HPO和DrugBank数据库中检索获得的疾病靶点进行去重合并。活性成分和腹泻的疾病靶点交叉部分共60个共同靶点被筛选为治疗腹泻的关键靶点(附件4)。
2.3 PPI网络的共同靶标对活性成分和腹泻疾病靶点进行交集，得到共有靶点60个。将60个共同靶点导入STRING数据库得到靶点相互作用结果，将结果导入Cytoscape软件构建PPI网络。该网络中，DC、CC和BC的中位值分别为28、0.82和2.68。≥中位数作为筛选标准，基于拓扑分析确定了核心PPI网络，分析后确定了10个核心靶点构成核心，根据Degree值筛选核心靶点，Degree值越大表示该靶点越可能成为理中汤治疗寒湿泄泻的核心靶点，在本研究中，筛选Degree值最高的前3个靶点作为核心靶点。结果显示，CASP3、EGFR、MMP9 Degree值前3的理中汤治疗腹泻的核心靶点。
2.4 GO功能富集分析将筛选到的理中汤治疗腹泻疾病的60个靶点通过DAVID数据库进行GO富集分析，包括生物过程(BP)、细胞组分(CC)和分子功能(MF)分析。GO分析获得BP、MF、CC分别为114、117、86条。根据P值分别以气泡图展示排名前20的条目。在每个类别中具有最高基因计数的前20个BP、MF、CC呈现为柱状图。5个富集度最高的CC包括质膜固有成分、质膜整体成分、神经元部分、质膜区、突触(附件5)。BP主要涉及到细胞对化学刺激的反应、对有机物质的反应等。MF主要富集在质信号传感器活动、酶结合等(附件6)。
2.5 KEGG通路富集分析通过DAVID数据库进行KEGG通路富集分析共富集了97个信号通路。对前20个高度富集的相关靶标和信号通路使用Cytoscape 3.8.0绘制“靶标-通路”网络。红色的箭头节点代表靶点，橙色的菱形节点代表通路。Sankey图的左侧矩形节点表示治疗靶点，右侧矩形节点表示KEGG通路，线表示靶点和通路的相互关系。理中汤治疗腹泻的信号通路主要有IL-17、动脉粥样硬化、TNF信号通路等。见附件7。
2.6 分子对接根据PPI核心网络筛选得到的，Degree值前3的腹泻疾病关键靶点分别为：CASP3、EGFR、MMP9个靶点和在中药-活性成分-靶点网络(附件3)分析中筛选出的15种化合物合并四味中药的10种有效成分共25种化合物(Tab 2)进行分子对接，对接结果见附件Fig 8。
结合能 < 0 kJ·mol-1表示配体与受体之间可以自发结合，结合能 < -20.9 kJ·mol-1表示配体与受体之间的结合性较好。结果显示，其活性成分与核心靶点蛋白的自由结合能在(-45.6~-19.7) kJ·mol-1范围内，均 < 0 kJ·mol-1，说明靶蛋白可与活性成分自发结合且稳定性较好。其中，在与formononetin(刺芒柄花素)、Calycosin(毛异黄酮)、Isoliquiritoside(芹糖异甘草苷)、glycitein(黄豆素)对接时MMP9的亲和力最高。使用PyMol1.7.2.1和DiscoveryStudio2020对结合能最低的前4个“配体-受体”组合进行可视化(附件9)。
2.7 寒湿泄泻大鼠模型临床症状造模后，DG(模型组)组大鼠精神萎靡、弓背蜷缩、饮食欲下降，倦怠懒动，扎堆聚集，粪便稀软，临床症状明显。
K组(空白对照组)大鼠前后爪粉嫩，丰满红润，趾爪舒展；DG组大鼠前后爪发青紫色，血液瘀滞，流通不畅，萎缩干瘪，趾爪蜷曲，符合寒证表现(Fig 1A)。K组睾丸在阴囊内自然下垂，肛周洁净无粪污，尾根清洁；寒湿泄泻DG组睾丸缩回腹部，阴囊干瘪，肛周有黏粪残留，尾根有粪污残留(Fig 1B左)。K组背部毛发柔顺光滑，清洁无脏污；DG组毛发潮湿打结，沾有黄色脏污(Fig 1B右)。K组肛周清洁无残留粪便；DG组肛周沾满黏液便残留，肛周毛发发黄黏腻；LZDG组(理中汤治疗组)肛周毛发打结，沾满干燥粪渣，且粪便已经成形；BTDG组(白头翁汤治疗组)肛周毛不洁，仍有黏液便(Fig 1C)。
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| Fig 1 The model constructed a clinical symptom map A: Comparison of front and hind toe claws; B: Back control (yellow arrow is group K, red arrow is DG group); C Tail comparison. |
各组体温变化趋势变化走向均保持一致(Fig 2A)。与K组相比，DG组大鼠体质量明显下降，而LZDG组和BTDG组均在d 6后逐步逆转DG组的体质量变化(Fig 2B)。除K组外，其余各组的采食量和饮水量均呈现先降低后升高的趋势，前3 d呈上升趋势，自d 3开始造模后逐渐减少，并于d 6后开始稳步回升(Fig 2C-2D)。
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| Fig 2 Trend chart of clinical indicators (n=12) A: Trend of body temperature; B: Trend of body weight; C: Trend of feed intake; D: Trend of water intake. |
K组大鼠回肠、结肠黏膜上皮细胞结构完整，肠腺轮廓清晰(Fig 3A-3E)；DG组大鼠回肠肠绒毛结构损伤严重，肠黏膜和隐窝部分结构被破坏并伴随局部充血，回肠和结肠均发现弥漫性炎症浸润(Fig 3B-3F)；给药后LZDG组和BTDG组结肠、回肠组织损伤得到恢复，炎性浸润有所改善(Fig 3C，3D，Fig 3G，3H)。
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| Fig 3 Ileum 40× (A-D) K group, DG group, LZDG group, BTDG group; Colon 20× (E-H) K group, DG group, LZDG group, BTDG group; Indicators of diarrhea (I-K) (n=12) I: Trend chart of loose stool rate; J: Trend of fecal water content; K: Trend chart of diarrhea index. |
K组的腹泻相关指标(稀便率、粪便含水量和腹泻指数)均无明显变化，但DG组稀便率在开始造模后急剧升高，并始终保持较高水平直至造模结束；DG组粪便含水量从造模开始后持续保持在90%左右，直至实验结束；DG组腹泻指数在开始造模后持续升高并维持在2.5左右；LZDG组和BTDG组的稀便率、粪便含水量和腹泻指数在治疗前变化趋势与DG组类似，均急剧升高，但给药后LZDG组和BTDG组的稀便率和粪便含水量均下降，但仍比正常对照组略高，d 9给药后LZDG组和BTDG组腹泻指数均开始降低，但未降低至正常对照组水平；经过理中汤给药后，与DG组相比，LZDG组和BTDG组均有药效，但LZDG组药效优于BTDG组(Fig 3I-3K)。
2.8.4 理中汤对寒湿泄泻大鼠ATP酶活性的影响与正常对照组相比，DG组的Na+-K+ ATP酶活性水平(P < 0.01)降低(Fig 4A)但LZDG组和BTDG组的Na+-K+ ATP酶活性水平有所恢复，但差异无统计学意义(P>0.05)；DG组的Ca2+-Mg2+ ATP酶活性降低(P < 0.01)(Fig 4B)，给药后，LZDG组的Ca2+-Mg2+ ATP酶活性都上升(P < 0.05)BTDG组则上升(P < 0.01)。
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| Fig 4 Effect of Lizhong decoction on ATPase activity in rats with cold and damp diarrhea (x±s, n=6) #P < 0.05, ##P < 0.01 vs K group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DG group. |
如Fig 5所示，DG组的血清中IL-6和TNF-α水平增加(P < 0.05)，IL-1β水平增加(P < 0.01)，IL-10水平降低(P < 0.01)，而LZDG组的血清中促炎性细胞因子(IL-6，TNF-α)水平降低(P < 0.05)，IL-1β水平降低(P < 0.01)，IL-10水平升高(P < 0.01)。
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| Fig 5 Chart of trend of underlying data (x±s, n=6) A: IL-6 content; B: IL-10 content; C: TNF-α content; D: IL-1β content.#P < 0.05, ##P < 0.01 vs K group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs DG group. |
Western blot分析如Fig 6所示，与K组相比较，DG组大鼠结肠组织中E-cadherin、Occludin(P < 0.01)和MMP9的蛋白表达量降低，ZO-1蛋白表达量降低(P < 0.05)。与DG组相比较，LZDG组大鼠结肠组织中E-cadherin、Occludin和MMP9蛋白表达量升高(P < 0.01)，ZO-1升高(P < 0.05)；BTDG组大鼠结肠组织中E-cadherin、Occludin、ZO-1和MMP9蛋白表达量有升高的趋势但差异无统计学意义(P>0.05)。
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| Fig 6 Expression of E-cadherin, Occludin, ZO-1 and MMP9 protein in rat colon tissue (x±s, n=3) A: E-cadherin expression; B: Occludin expression; C: ZO-1 expression; D. MMP9 expression. #P < 0.05 vs K group; *P < 0.05 vs DG group. |
本研究通过网络药理学对理中汤治疗腹泻的作用机制进行探讨，理中汤活性成分主要为黄酮类：木犀草素、芹糖异甘草苷；异黄酮类：刺芒柄花素、毛蕊异黄酮、黄豆黄素。其中，木犀草素在金银花、紫苏叶等具抗病毒、抗炎作用的植物种含量较高，可通过激活GSK3β/Nrf2通路抑制感染性炎症反应，还可通过降低促炎细胞因子IL-6和TNF-α等的合成与分泌，发挥抗炎作用[13]。芹糖异甘草苷属于查尔酮类成分具有抗癌、抗炎等药理作用[14]。刺芒柄花素可通过TFEB介导的溶酶体生物合成改善肝脏脂肪变性，进而影响动物机体产热能力[15]。毛蕊异黄酮可抑制炎症、氧化应激反应[16]。黄豆黄素被证实具有抗肿瘤[17]、抗氧化和提高机体免疫功能等作用，能够预防和治疗乳腺癌、结肠癌和皮肤癌。
GO功能显示，理中汤的治疗作用与许多生物学过程有关，包括细胞对化学刺激的反应、对有机物质的反应等。KEGG结果显示，理中汤治疗腹泻是通过多种途径的，主要与IL-17、动脉粥样硬化等信号通路相关，与腹泻相关的排名最高的是IL-17信号通路。先前的研究已经证明，IL-17信号通路通过降低促炎因子(IL-1β、IL-17α、IL-6)、MMP 14、MMP3等的表达，减轻腹泻小鼠的氧化应激和炎症反应。由于促炎细胞因子如TNF-α的减少，抑制IL-17信号传导通路可缓解小鼠模型中的UC症状和组织学损伤[18]。因此，理中汤缓解腹泻的潜在机制可能与IL-17信号通路中的MMP 9有关(附件10)。
分子对接技术结果表明，MMP9与刺芒柄花素、毛蕊异黄酮等的结合能都 < -41.9 kJ·mol-1，表明它们之间具有良好的结合活性，因此基质金属蛋白酶-9(MMP9)可能是理中汤治疗寒湿泄泻的主要作用靶点。已有研究结果表明，慢性炎症使上皮黏膜屏障暴露于炎性介质如细胞因子和抗菌肽(AMP)，导致肠道菌群失调和免疫应答失调，促炎细胞因子如IL-6、IL-1β、TNF-α、IFN-γ的增加可能是蛋白酶MMP9的蛋白水解活性的结果。许多研究显示，腹泻的发生与炎症反应有着一定的关联，目前已被证实的众多细胞因子一般被划分为抗炎因子与促炎因子两大类，促炎因子有IL-6、TNF-α、IL-1β等[19]。本研究结果显示，DG组大鼠的IL-1β、IL-6和TNF-α水平明显增加，而IL-10水平明显降低表明炎症反应加剧上述结果与先前的研究结果一致。经理中汤干预后上述细胞因子变化趋势均发生逆转，表明理中汤能有效抑制炎性因子表达，减轻腹泻症状。
肠道机械屏障由肠上皮紧密连接蛋白与闭合蛋白ZO-1等组成，如果紧密连接受损会导致肠黏膜通透性增加，这是包括腹泻在内的多种肠道疾病的共同特征[20]。本研究中，DG组大鼠肠道屏障受损严重，蛋白表达量低于其他组，经过理中汤或白头翁汤干预后，紧密连接蛋白表达量的变化趋势均发生逆转。寒湿泄泻大鼠的ATP酶水平也远低于正常大鼠，经过治疗后大鼠的ATP酶水平有所回升，这表明环境温度对大鼠腹泻发病也有影响，但其调节机制尚不明确，寒湿泄泻大鼠在能量代谢方面仍需深入研究。
综上所述，理中汤通过特定靶点发挥治疗作用。刺芒柄花素、毛蕊异黄酮、芹糖异甘草苷、黄豆黄素、木犀草素可能是理中汤治疗寒湿泄泻的主要活性化合物。此外，理中汤可以通过多种途径，例如IL-17、动脉粥样硬化、TNF等信号通路发挥治疗作用。
(该文附加材料请到中国知网增强出版或本刊官网http://www.zgylxtb.cn该文章“附录”栏下载。)
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