2. 中国中医科学院中医基础理论研究所，北京 100700
2. Institute of Basic Chinese Medicine Theory, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China
心肌肥厚(hypertrophiccardiomyopathy，HCM)主要病理表现为心肌细胞体积增大等，是心力衰竭发生的重要原因之一，易导致心律失常和猝死[1]，由于HCM病因和发病机制的复杂性，目前并没有有效的防治方法。异丙肾上腺素(isoprenaline，ISO)是一种β肾上腺素受体激动剂，已成为大鼠心肌肥厚动物模型造模的常用方案之一。但目前ISO注射剂量和注射时间并不统一差异较大，并未明确一个可重复、固定的造模方法。因此，建立一个可靠的ISO药物注射HCM模型，探究ISO造模心肌肥厚更加有效的注射剂量，选取1、3和5 mg·kg-1ISO剂量，探究大鼠心肌肥厚模型的建立方法。
1 材料与方法 1.1 实验动物SPF级♂ SD大鼠48只，8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证号SCXK(京)2019-0008，于山西中医药大学清洁级动物房饲养，温湿适宜，标准化饲养，自由进食水。实验由山西中医药大学实验动物伦理审查委员会审查通过(No AWE202403007)。
1.2 主要试剂与仪器盐酸异丙肾上腺素注射液(批号：H50020020)，西南药业股份有限公司；ANP、BNP和ATP ELISA试剂盒(货号：MM-21097R2；MM-0067R2；MM-21276R2)江苏酶免实业有限公司；超声诊断仪(型号：EPIQ7CEXP)飞利浦医疗(苏州)有限公司；小动物麻醉机-移动式(R520IE)，深圳市瑞沃德生命科技有限公司。
1.3 方法 1.3.1 实验分组及大鼠心肌肥厚模型的建立将48只大鼠随机分为空白组、1、3、5 mg·kg-1ISO组，每组12只，进行背部皮下注射，空白组注射等体积生理盐水，每天1次，连续注射10 d。造模过程中1和3 mg·kg-1组各死亡2只，死亡率为16.67%，5 mg·kg-1组死亡4只，死亡率为33.33%。
1.3.2 超声检测大鼠心脏功能使用超声系统对左心室功能相关参数进行评价。
1.3.3 大鼠体质量和心脏质量称量大鼠体质量(BW)，取大鼠心脏组织，称量全心质量(HW)和左心室心肌质量(LVW)，计算心脏体质量指数(HMI=HW/BW)以及左心室质量指数(LVMI=LVW/BW)[2]。
1.3.4 苏木精-伊红(HE)、Masson染色和免疫荧光染色观察心肌组织取大鼠心肌组织，制作切片，分别进行HE染色、Masson染色和WGA免疫荧光染色[3]。利用浏览器软件对切片进行分析，使用ImageJ软件进行胶原容积分数(collagen volume fraction，CVF)分析统计心肌纤维化程度。
1.3.5 酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清心肌肥厚相关指标水平按试剂盒说明测定ANP、BNP和ATP水平。
1.4 统计学方法运用SPSS 25.0进行统计分析。数据资料结果以x±s表示，采用单因素方差分析进行组间比较。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 各组大鼠心功能参数的比较大鼠心功能超声结果，如Tab 1所示。与空白组相比，1、3和5 mg·kg-1组舒张室间隔厚度(IVSd)和左心室后壁厚度(LVPWd)均明显升高
| Group | n | LVPWd/mm | IVSd/mm | EF/% | FS/% |
| Blank | 12 | 1.17±0.13 | 1.11±0.09 | 86.91±5.49 | 68.26±3.48 |
| 1 mg·kg-1 | 10 | 1.33±0.13* | 1.22±0.07* | 80.97±3.13* | 55.58±6.42** |
| 3 mg·kg-1 | 8 | 1.66±0.09* | 1.58±0.07* | 57.80±3.64** | 46.93±2.49** |
| 5 mg·kg-1 | 8 | 1.67±0.09* | 1.60±0.04* | 55.58±3.06** | 47.13±3.90** |
| *P<0.05, **P<0.01 vs Blank. | |||||
(P < 0.05)，与空白组相比，1 mg·kg-1组左心室射血分数(EF)降低，和左心室短轴缩短率(FS)明显降低(P < 0.01)，3和5 mg·kg-1组EF和FS均有明显下降(P < 0.01)。
2.2 各组大鼠的心肌肥大指数的比较与空白组相比，1 mg·kg-1组大鼠BW体质量增长缓慢(P < 0.05)，3和5 mg·kg-1组大鼠体质量增长缓慢(P < 0.01)。与空白组相比，1、3和5 mg·kg-1组的HMI和LVMI均明显增加(P < 0.01)。1、3、5 mg·kg-1组之间比较差异无统计学意义，结果见Tab 2。
| Group | n | BW/g | HMI/mg·g-1 | LVMI/mg·g-1 |
| Blank | 12 | 362.11±6.33 | 3.30±0.30 | 2.45±0.14 |
| 1 mg·kg-1 | 10 | 348.59±9.33* | 4.50±0.40** | 3.05±0.16** |
| 3 mg·kg- | 8 | 334.76±13.59** | 4.83±0.36** | 3.31±0.18** |
| 5 mg·kg-1 | 8 | 340.36±11.66** | 4.75±0.40** | 3.30±0.30** |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs Blank. | ||||
HE染色显示，空白组大鼠心肌细胞排列整齐、形态正常；而随着ISO剂量增加(1、3和5 mg·kg-1)，心肌细胞排列逐渐紊乱，形态改变，细胞肥大，且炎症细胞浸润增多。Masson染色进一步揭示，空白组心肌纤维排列整齐，颜色鲜红；而剂量组心肌纤维排列紊乱，纤维增粗，并出现蓝色阳性信号，表示纤维化程度增加。且随着剂量上升，纤维化面积扩大。。通过胶原容积分数比较，与空白组相比，各剂量组CVF均明显升高(P < 0.01)，且1 mg·kg-1组与其他剂量组差异有统计学意义(P < 0.01)，但3和5 mg·kg-1组比较差异无统计学意义。此外，细胞膜标志物WGA免疫荧光染色表明，随着剂量增加，心肌细胞形态变得更加不均一，细胞膜连续性受损，膜结构损伤加重。
2.4 各组大鼠血清ANP、BNP和ATP的水平与空白组相比，1 mg·kg-1组大鼠血清中ANP、BNP增长(P < 0.05)，3和5 mg·kg-1组大鼠血清中ANP、BNP明显增长(P < 0.01)，1、3和5 mg·kg-1组ATP明显降低(P < 0.01)，见Tab 3。
| Group | n | ANP | BNP | ATP/μmol·L-1 |
| Blank | 12 | 158.62±15.31 | 258.31±39.42 | 4.11±0.43 |
| 1 mg·kg-1 | 10 | 176.16±5.72* | 293.84±17.18** | 3.44±0.42** |
| 3 mg·kg-1 | 8 | 187.28±19.21* | 315.16±25.98** | 3.25±0.32** |
| 5 mg·kg-1 | 8 | 189.01±14.79** | 320.70±26.84** | 3.09±0.48** |
| *P < 0.05, **P < 0.01 vs Blank. | ||||
心肌肥厚初为心脏代偿，长期或转为病理性，导致心力衰竭[4]。本研究结果显示，异丙肾上腺素剂量为1、3和5 mg·kg-1，每日1次，连续注射10 d，采取皮下背部多点注射方式，均可建模，且3 mg·kg-1为最佳剂量，造模效果更好，但可根据具体实验情况，剂量酌情加减。
| [1] |
Bazgir F, Nau J, Nakhaei-Rad S, et al. The microenvironment of the pathogenesis of cardiac hypertrophy[J]. Cells, 2023, 12(13): 1780. |
| [2] |
张诗吟, 李国栋, 孙启银, 等. 曲尼司特减轻异丙肾上腺素诱导心肌肥厚和纤维化的研究[J]. 中国临床药理学杂志, 2023, 39(7): 966-70. Zhang S Y, Li G D, Sun Q Y, et al. Tranilast reduces myocardial hypertrophy and fibrosis induced by isoproterenol[J]. Chin J Clin Pharmacol, 2023, 39(7): 966-70. |
| [3] |
Lin Z R, Li Z Z, Cao Y J, et al. GDH promotes isoprenaline-induced cardiac hypertrophy by activating mTOR signaling via elevation of α-ketoglutarate level[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2022, 395(11): 1373-85. |
| [4] |
王钺镁, 喻文静, 孙袭孟, 等. Cortactin/N-cadherin信号轴在病理性心肌肥大中的作用[J]. 中国药理学通报, 2024, 40(2): 234-42. Wang Y M, Yu W J, Sun X M, et al. Function of Cortactin/N-cadherin signal axisin pathological myocardial hypertrophy[J]. Chin Pharmacol Bull, 2024, 40(2): 234-42. doi:10.12360/CPB202309053 |