非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是肝病最常见的原因之一，常伴有肥胖、糖尿病、血脂异常、血压异常等代谢紊乱。在我国，NAFLD的患病率为20%~30%，并且患病率呈逐年上升趋势[1]。NAFLD不仅可以引起肝脏的脂肪变性，还会引起代谢综合征，严重时甚至会引起肝硬化和肝癌。
降脂理肝汤(Jiangzhi Ligan decoction，JZLGD)为名老中医张云鹏治疗NAFLD的临床经验方，由丹参、泽泻、决明子、郁金、海藻和荷叶六味中药组成。该方化痰浊沉积，散瘀血积聚，从而消除肝内瘀积，使得血中痰浊得以清降，从而对NAFLD发挥较好的干预作用[2]。且有研究表明[3]，JZLGD可减轻NAFLD大鼠肝脏中的病理损伤，改善肝功能，有效治疗NAFLD。但是，JZLGD治疗NAFLD的研究主要集中于临床和简单的药效实验，作用机制仍不明确。
本研究基于网络药理学探讨JZLGD治疗NAFLD的活性成分、核心靶点及潜在作用通路，并以棕榈酸(palmitic acid，PA)诱导的HepG2细胞为模型，探讨JZLGD调控NAFLD的药效及作用机制，以期为其临床应用及深入研发提供科学依据。
1 材料 1.1 实验药物泽泻、丹参、决明子、郁金、海藻、荷叶购于北京同仁堂药店。
1.2 动物及细胞系健康成年♂ SD大鼠体质量(190~230) g，购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于山东中医药大学实验动物中心屏障设施，实验动物生产许可证编号：SCXK(京)2021-0006，动物实验设施许可证编号：SPF202311049。
1.3 主要实验试剂DMEM基础培养基(货号150410)、胎牛血清(货号164210)均购自武汉普诺赛公司；胰蛋白酶(货号25200056)购自美国Gibco公司；PA(货号P0500)购自默克公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号P0012)购自碧云天；TC试剂盒(货号F002-1-1)、TG试剂盒(货号A110-1-1)均购自南京建成生物工程研究所；β-actin(货号4967)、LC3(货号83506)、p62(货号5114)、AMPKα(货号2532)和phospho-AMPKα(货号2531)均购自CST公司；辣根酶标记山羊抗兔IgG(货号ZB-2301)、辣根酶标记山羊抗兔IgG(货号ZB-2305)均购自中杉金桥；AMPK抑制剂(货号171260-1MG)购自Millipore Sigma；氯喹(货号10 mmol·L-1)购自MCE公司。
1.4 主要实验仪器酶标仪(Bio-Tek，Epoch2)、微孔板恒温振荡器(杭州佑宁仪器有限公司，WZ80-2)、凝胶图像分析系统(上海天能科技有限公司，Tanon 4800Multi)。
2 方法 2.1 JZLGD活性成分筛选及靶点预测应用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)查找JZLGD中六味中药丹参、荷叶、海藻、泽泻、郁金、决明子所含成分，并综合口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和类药性(drug likeness，DL)筛选活性成分。将OB≥30%和DL≥0.18设置为参数进行筛选，并结合2020版《中国药典》和相关文献进行成分补充。将活性成分化合物信息导入SwissTargetPrediction数据库(http://swisstargetprediction.ch/)获取化合物靶点，并通过TCMSP数据库和BATMAN数据库(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)进行靶点补充。
2.2 获取NAFLD相关靶点及获取交集基因以“nonalcoholic fatty liver”为关键词在GeneCards数据库(https://www.genecards.org)与OMIM数据库(https://www.omim.org)筛选疾病靶点，通过Venny2.1.0将药物靶点与疾病靶点取交集。
2.3 PPI网络构建将交集基因导入STRING11.5数据库(https://string-db.org/)构建蛋白互作(protein-protein interaction，PPI)网络模型，将生物类别设置成“Homo sapiens”，最小互作阈值设置成“medium confidence”(>0.4)，下载TSV文件并通过CytoScape3.9.1对JZLGD对治疗NAFLD的核心蛋白网络进行可视化处理，绘制PPI网络图，通过Network Analyzer分析PPI节点的拓扑参数，根据度值获取核心靶点。
2.4 药物-成分-靶点网络通过Cytoscape 3.9.1软件，对药物、活性成分、靶点之间的联系进行网络图谱，以系统分析JZLGD治疗NAFLD的潜在作用靶点并筛选主要有效成分。
2.5 GO分析和KEGG通路富集分析将JZLGD治疗NAFLD的交集基因输入Metascape数据库(https://metascape.org/)，设置P < 0.01，分析其主要的生物学过程。
2.6 分子对接验证从RCSB PDB数据库(https://www.rcsb.org/)和AlphaFold数据库(https://alphafold.ebi.ac.uk/)检索下载核心靶点的3D结构PDB格式文件，小分子化合物3D结构从PubChem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获取SDF文件，利用OpenBabel-3.1.1软件将SDF文件转为mol2文件，使用Pymol 2.4.0对大分子蛋白靶点去水，去配体，使用AutodockTool 4.0软件将二者进行加氢、计算电荷、确定原子类型处理后保存为pdbqt格式文件备用。采用Autodock Vina对关键成分与核心靶点及自噬相关靶点进行分子对接验证。最后通过Discovery软件将对接结果可视化及相关信号通路，将分析结果导入微生信平台(www.bioinformatics.com.cn)进行可视化。
2.7 JZLGD的制备JZLGD方剂组成为泽泻10 g、决明子30 g、丹参10 g、郁金10 g、海藻30 g、荷叶10 g。根据课题组前期对JZLGD提取工艺的优化结果，提取工艺如下：将药材于11倍量水中，沸后煎煮90 min，提取3次，合并滤液减压浓缩后置于4 ℃冷藏储存。
2.8 含药血清制备健康成年♂ 16只SD大鼠随机分为2组，空白对照组8只、JZLGD给药组8只，采用2倍临床常用剂量给药(21 g·kg-1·d-1)，每日2次，连续7 d。末次给药后1 h麻醉，腹主动脉取血，常温静置0.5 h，3 000 r·min-1离心10 min后取上清血清，0.22 μm微孔滤膜过滤，-80 ℃保存备用[4]。
2.9 细胞培养HepG2细胞在37 ℃，5% CO2培养箱中，用含10%胎牛血清、1%双抗的DMEM培养基培养，待细胞汇合度为90%左右时，取对数生长期的细胞用于实验。
2.10 MTT法检测含药血清对细胞活力的影响取对数生长期的HepG2细胞，接种于96孔板，每孔1×104个细胞，10%、15%及20%的空白血清及JZLGD含药血清给药24 h后，每孔加入20 μL MTT试剂培养4 h后，用150 μL的DMSO在室温下摇床上培养10 min，使结晶物充分融解，用酶标仪在490 nm波长下测量吸光度，确定对细胞活力没有影响的血清浓度。
2.11 NAFLD细胞模型的建立及分组给药HepG2细胞以3×108·L-1接种于6孔培养板中，细胞贴壁后，模型组加入终浓度为200 μmol·L-1 PA的培养基培养24 h[5]，造模完成后，给予如下处理：对照组(培养基+20%空白血清)、模型组(培养基+20%空白血清)、JZLGD含药血清低剂量组(培养基+10% JZLGD含药血清+10%空白血清)，JZLGD含药血清中剂量组(培养基+15% JZLGD含药血清+5%空白血清)，JZLGD含药血清高剂量组(培养基+20% JZLGD含药血清)，继续培养24 h，进行后续检测。
2.12 细胞给药及TG、TC含量的检测给药结束后，加入胰酶进行消化得到细胞悬液，将制备好的细胞悬液转移至EP管并加入细胞裂解液，裂解后用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，根据试剂盒说明书进行TC及TG检测[6]。
2.13 油红O染色检测JZLGD含药血清对HepG2细胞内的脂质的影响给药结束后，加PBS漂洗3次，再用PBS漂洗3次，加已配油红O工作液染色10 min，再用PBS漂洗3次，然后加60%异丙醇浸润10 s，最后用PBS洗3次，置于倒置显微镜下观察并拍照。
2.14 Western blot法检测自噬相关蛋白的表达将给药结束后，吸弃上清，PBS轻洗3次，每孔加入150 μL裂解液，置于冰上裂解30 min，4 ℃ 12 000 r·min-1离心15 min取上清，用BCA试剂盒检测蛋白浓度，调至统一浓度后，加入5×Loading Buffer混匀，96 ℃、10 min进行蛋白变性。配制10%和15%丙烯酰胺凝胶，每孔上样30 μg，按80 V 30 min，120 V 60 min进行电泳[7]；260 mA转膜2 h，5%脱脂奶粉室温封闭3 h，按1 ∶ 1 000稀释β-actin、AMPKα、p-AMPKα、LC3和p62一抗，4 ℃摇床孵育过夜；次日，将膜用TBST洗5次，每次5 min，室温孵二抗2 h，TBST洗5次，每次5 min，配制显影液，用凝胶成像仪成像分析。
2.15 CC和CQ对JZLGD治疗NAFLD的干预作用取生长状态良好，汇合度为90%的HepG2细胞，接种于6孔板，每孔30×104个细胞，在37 ℃，5%CO2下培养24 h，加入含药培养基和PA 2 mL，同时设置正常对照组和模型对照组，H+CC和H+CQ组，加入CC(10 μmol·L-1)[8]和CQ(20 μmol·L-1)[9]JZLGD干预24 h。将制备好的细胞悬液转移至EP管，1 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀。用PBS洗1~2次，1 000 r·min-1离心10 min，弃上清液，留细胞沉淀。加入0.1 mL PBS进行匀浆，冰水浴条件下加入TritonX-100，2%裂解液进行裂解，裂解好的液体用试剂盒检测各孔的TG、TC含量；用BCA蛋白定量试剂盒检测各孔蛋白浓度；计算各孔TG、TC含量与蛋白浓度的比值，即为各孔TG、TC的相对含量，实验重复3次。
2.16 统计学方法通过GraphPad Prism 8.0软件进行处理，数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析，检验水准α=0.05。
3 结果 3.1 JZLGD有效成分的筛选与靶点预测从TCMSP数据库中以OB≥30%，DL≥0.18为条件，并通过文献检索对候选活性成分补充[10-14]，共检索到JZLGD活性成分161个，其中丹参68个，海藻5个，荷叶25个，决明子24个，郁金21个，泽泻18个。通过Swiss Target Prediction数据库查询161个成分的相关靶点，筛选可能性值≥0.6的靶点为可能靶点，并通过TCMSP数据库、BATMAN数据库补充，剔除无靶点成分，最终得到靶点812个，清除重复项后得373个靶点，涉及有效成分64个(见中国知网本文增强出版附加材料1)。
3.2 交集基因根据GeneCards数据库与OMIM数据库所找疾病靶点，通过Venny2.1.0网站与药物靶点取得交集基因(Fig 1)，共109个(见中国知网本文增强出版附加材料2)。
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| Fig 1 Number of potential targets for treatment of NAFLD by JZLGD |
将JZLGD与NAFLD交集基因导入String网站，获得PPI图(Fig 2)。其中节点数108、边数1093、平均节点度20.2、平均局部聚类系数0.615；网络节点代表蛋白质，连线代表蛋白质之间的相互作用。邻接节点个数越多，成为关键基因的概率越大。将String网站输出结果导入在Cytoscape 3.9.1软件，采用CytoNCA计算网络节点的dgree值，根据dgree值大小排序，筛选出胰岛素(insulin，INS)、苏氨酸蛋白激酶(RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1)、肿瘤坏死因子配体(tumor necrosis factor，TNF)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARγ)等核心靶点(Tab 1)。
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| Fig 2 JZLGD in NAFLD target protein PPI network diagram |
| Target | DC | EC | BC | CC |
| INS | 70 | 0.21385805 | 1304.6925 | 0.7394366 |
| AKT1 | 66 | 0.21338384 | 740.4505 | 0.7191781 |
| TNF | 65 | 0.21355136 | 628.978 | 0.7094595 |
| PPARG | 58 | 0.18538475 | 826.3457 | 0.6730769 |
| TP53 | 55 | 0.19419509 | 383.70145 | 0.6603774 |
| IL1B | 53 | 0.18883392 | 346.87756 | 0.65625 |
| STAT3 | 52 | 0.18850568 | 253.77391 | 0.6402439 |
| HSP90AA1 | 50 | 0.17262 | 465.64575 | 0.6402439 |
| EGFR | 50 | 0.17301042 | 370.74857 | 0.6441718 |
| CASP3 | 49 | 0.1843369 | 203.14464 | 0.6363636 |
根据PPI网络数据找出的关键靶点，将药物、关键靶点、关键靶点相关成分等信息导入Cytoscape 3.9.1软件，得到药物-成分-关键靶点网络(Fig 3)，结合成分的水溶性及2020年版《中国药典》对各味中药指标性成分的规定，选取隐丹参酮、荷叶碱、儿茶素、丹参素、槲皮素、芦荟大黄素作为主要有效成分。
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| Fig 3 Diagram of "drug-composition-key target" network of JZLGD for NAFLD |
通过metascape网站对相关靶点蛋白进行GO功能注释分析，包括细胞组分、分子功能和生物过程3部分。选取P值最小的前10个进行作图呈现(Fig 4)。结果发现，这些蛋白在生物过程方面主要涉及对激素的反应、对异生刺激的反应、磷酸化的正向调节、细胞对脂质的反应、小分子代谢过程的调控等过程；在细胞组分方面主要参与膜筏、裂解液泡、神经元细胞体等部分；在分子功能方面主要包括核受体活性、氧化还原酶活性、蛋白同源二聚化活性等过程。
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| Fig 4 GO functional enrichment analysis |
通过metascape网站进行KEGG通路富集分析，设置P < 0.01，选取排名前15的结果进行数据可视化。富集的KEGG通路主要包括胰岛素抵抗、NAFLD、AMPK信号通路、酒精性肝病、HIF-1信号通路、mTOR信号通路、自噬等(Fig 5)。值得注意的是，AMPK信号通路及mTOR信号通路都与自噬存在密切的联系，提示JZLGD干预NAFLD的作用机制与自噬紧密相关。
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| Fig 5 KEGG path analysis |
采用Autodock Vina对选取的关键成分与排名前4的核心靶点及自噬相关靶点进行分子对接验证，对接结果见Tab 2。一般认为，结合能 < -20.9 kJ·mol-1，表明靶蛋白与活性成分结合性较好，且结合能越小表明两者对接越好。结果表明，关键成分与关键靶点及自噬相关靶点大部分可以较好结合，结合能TOP5分别为隐丹参酮-mTOR、荷叶碱-mTOR、槲皮素-PPARG、荷叶碱-AMPK、芦荟大黄素-mTOR(Fig 6)。
| Component name | INS | AKT1 | PPARG | TNF | AMPK | mTOR | LC3b | p62 |
| Source | PDB | PDB | PDB | PDB | PDB | PDB | AlphaFold | AlphaFold |
| ID | 7nhu | 7myx | 6t1s | 5uui | 4eai | 4dri | Q9GZQ8 | Q13501 |
| Cryptotanshinone | -7.4 | -7.6 | -8.3 | -7.7 | -8.7 | -10.7 | -8.1 | -7.1 |
| (-)-catechin | -5.6 | -6.3 | -8.7 | -6.6 | -8.4 | -8.6 | -7.3 | -6.8 |
| Aloe-emodin | -6.2 | -6.8 | -7.1 | -6.8 | -8.7 | -9.2 | -7.5 | -6.1 |
| Quercetin | -5.9 | -6.7 | -9.6 | -6.9 | -8.5 | -9.1 | -7.5 | -7.1 |
| Tanshinol A | -4.9 | -5.4 | -6.7 | -6.2 | -6.9 | -6.5 | -6.1 | -5.3 |
| Nuciferin | -6.3 | -6.3 | -7.4 | -6.5 | -9.4 | -9.6 | -7.3 | -6.2 |
| Atorvastatin calcium | -6.7 | -7.6 | -7.5 | -6 | -8.6 | -9.9 | -7.5 | -6.1 |
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| Fig 6 Binding energy TOP5 docking results |
如Fig 7所示，与对照组比较，10%及15%的空白血清及含药血清会不同浓度地降低细胞活力，20%空白血清及含药血清对HepG2细胞均无影响，因此，后续实验选用20%浓度的血清。
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| Fig 7 Effect of JZLGD drug-containing serum on HepG2 cell viability (x±s, n=6) **P<0.01 vs Control group. |
如Fig 8所示，PA诱导的HepG2细胞内TG和TC含量明显高于正常对照组，说明胞内脂质蓄积明显；JZLGD含药血清干预后，TG、TC的水平呈剂量依赖性下降，且高剂量组的效果尤为明显，说明JZLGD含药血清可以明显抑制肝脏脂质蓄积。
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| Fig 8 Micrograph of effect of JZLGD drug-containing serum on lipid accumulation in HepG2 cells |
通过油红O染色观察细胞内脂质沉积的差异。如Fig 9所示，与对照组相比，PA诱导的HepG2细胞内出现大片橘色染色，脂滴大且多，表明细胞内脂质沉积明显增加，经JZLGD含药血清干预后，细胞内橘红色染色明显减少，脂质沉积随JZLGD含药血清给药剂量的增加而逐渐减少。
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| Fig 9 Effect of JZLGD drug-containing serum on TG and TC contents in PA-induced HepG2 cells (x±s, n=3) ##P < 0.01 vs Control group; *P < 0.05, **P<0.01 vs Model control group. |
如Fig 10所示，与对照组相比，模型组LC3Ⅱ的表达水平明显降低，而p62表达量明显升高，说明自噬信号通路受到抑制；JZLGD含药血清处理后，与模型组相比，LC3Ⅱ的表达水平提升，同时下调p62水平，其中以高剂量组效果明显。通过检测AMPKα和p-AMPKα的蛋白表达水平，各组AMPKα的表达没有明显差异，模型组p-AMPKα/AMPKα比对照组明显降低，JZLGD含药血清干预后，AMPK磷酸化程度升高。提示JZLGD含药血清很有可能通过AMPK调节自噬。
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| Fig 10 Expression of autophagy related proteins in HepG2 cells by JZLGD drug-containing serum (x±s, n=3) ##P < 0.01 vs Control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model group. |
如Fig 11所示，与对照组相比，模型组TC、TG水平明显降低，H-JZLGD干预后，可以降低TG水平，H+CC和H+QC干预后，TG水平升高，说明JZLGD含药血清可能通过AMPK调控自噬改善NAFLD。
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| Fig 11 Effects of CC and CQ on the intervention of TC and TG in NAFLD by JZLGD drug-containing serum (x±s, n=3) ##P < 0.01 vs Control group; *P < 0.05, **P < 0.01 vs Model group; & P < 0.05, &&P < 0.01 vs H-JZLGD group. |
中医认为，NAFLD属“肝癖”“肝积”“胁痛”等中医学范畴，“痰瘀阻络”为NAFLD发生发展的重要病机[15]。痰瘀互结，痰湿与瘀血易于胶结凝固，形成痰浊瘀血等浊毒并毒损肝络，导致肝失疏泄加重，周而复始，导致NAFLD的发生和发展[16-18]，能够清除“痰浊瘀血”的化痰祛瘀类中药在NAFLD治疗中发挥重要作用[19]。
中医认为精微滞留蓄积而为浊，细胞中衰老的细胞器、错误合成的蛋白质，都是中医”痰瘀”在细胞微观层面上的体现，所以在NAFLD病变中所表现出的胆固醇、TG升高，也是其痰浊的物质基础和微观体现[20]。而自噬通过对自身胞质内物质和(或)细胞器进行包裹吞隆形成自噬体，进一步与溶酶体发生融合形成自噬溶酶体，最终将吞噬物降解，供给细胞重新利用或排出细胞外，进而稳定细胞形态和结构，对维持细胞正常功能具有重要意义[21]。自噬是肝细胞脂类代谢的关键环节，可以通过降解脂滴直接参与脂质代谢。自噬受到抑制时，可出现脂肪变性，导致明显的脂质沉积[22]。其发生与肝细胞脂类代谢平衡密切相关，在NAFLD发生发展中发挥关键作用。在NAFLD长期慢性脂质刺激下，自噬功能异常，引起肝脏脂肪蓄积，进而加剧肝脏代谢异常。因此，以自噬通路为靶点对祛瘀化痰类中药进行防治NAFLD的研究，为中医药治疗此病提供新的思路。
本研究网络药理学及分子对接方法结果表明，JZLGD可以通过胰岛素抵抗、AMPK、mTOR、自噬等信号通路干预NAFLD。AMPK作为细胞能量状态的主要传感器，参与脂质代谢、糖代谢等能量物质代谢过程，AMPK亦是调节细胞自噬的经典信号通路之一[23]，因此，推测JZLGD可以通过AMPK调节自噬干预NAFLD。
NAFLD模型组细胞中p-AMPK、LC3Ⅱ表达水平明显降低，p62表达水平升高，说明AMPK-自噬通路确实受到抑制，JZLGD含药血清干预后，p-AMPK及LC3Ⅱ表达水平明显回升，p62表达水平下降，说明JZLGD可以激活AMPK诱导的自噬，及时清除TG、TC等痰浊瘀血，改善NAFLD。同时，加入CC和CQ干预后，抑制了JZLGD含药血清治疗NAFLD的作用，同样能够证明上述结果。
综上所述，JZLGD通过AMPK调控自噬通路从而改善肝脏脂肪变性，缓解脂质蓄积。
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