2. 军事科学院军事医学研究院毒物药物研究所，抗毒药物与毒理学国家重点实验室，北京 100850
2. State Key Laboratory of Antidrug and Toxicology, Institute of Toxicology and Drug Research, Military Medical Research Institute, Academy of Military Sciences, Beijing 100850, China
五羟色胺(5-HT)作为一种在神经生物学中占有独特地位的神经递质，其与睡眠、食欲、幻觉、疼痛、体温调节、激素分泌等多种生理过程密切相关。因为5-HT最初是在血清中被发现的，因此其又称为血清素。血清素作用的发挥需要受体的介导，目前已经发现多种5-HT受体，从5-HT1到5-HT7共7种类型，并且在其14种不同亚型的受体中，除5-HT3受体是配体门控离子通道外，其余受体皆为G蛋白偶联受体，能够通过激活细胞内相应的第二信使而产生对应的生理效应[1]。其中，5-HT2A受体由于其众多且复杂的功能以及在各类精神疾病中的治疗潜力等方面而备受关注。5-HT2A受体具有的多种生理功能与其结构密切相关，因此，对其结构与功能之间的关系进行研究，有助于阐明5-HT2A受体的生理功能，同时也有助于发现作用于5-HT2A受体的新药物作用位点，为相应疾病的治疗提供新思路。
1 5-HT2A受体的结构分析5-HT2A受体是一种A型G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)，也称视紫红质样受体。5-HT2A受体为7次跨膜螺旋结构(transmembrane helice，TM1-7)，同时由3个细胞内环(intracellular loop，ICL)和3个细胞外环(extracellular loop，ECL)组成。GPCR信号传导机制中的信号主要通过受体蛋白的构象变化来转移到细胞内部，而这些变化由受体与配体的结合引起。在非激活状态下，GPCR与异源三聚体G蛋白复合物处于非结合状态，其中G蛋白由α、β、γ 3个不同的亚基构成，α亚单位有鸟苷酸结合位点及鸟嘌呤三核苷酸磷酸(guanine trinucleotide phosphate，GTP)酶活性，此时α亚单位与鸟嘌呤二核苷酸磷酸(guanine dinucleotide phosphate，GDP)结合。当配体与受体结合时，使得受体由非激活状态向激活状态转变，这种变化通过蛋白质结构域动力学传递给异源三聚体G蛋白中的Gα亚基。激活的Gα亚基结合GTP，进一步触发Gα亚基从Gβγ二聚体和受体解离，激活第二信使，引发一系列级联活动[2]。此外，当配体与受体结合时，也会与受体结合口袋中的位点产生相互作用，在结合位点附近会发生微小的局部结构变化，降低受体由静息状态转向激活状态所需的势能，使受体更容易与G蛋白结合[3]。
一项解析5-HT2A受体晶体结构的研究发现，5-HT2A受体处于非激活状态时，其结构表现出两个重要特征[4]。第一个特征是在受体与配体结合口袋的底部有一个疏水裂隙，该底部疏水裂隙被高度保守的疏水残基所包围。第二个特征是在TM4和TM5之间有一个侧延伸空腔，侧延伸空腔被TM3、TM4、TM5和细胞外环上保守性较差的疏水残基所包围，其中Gly238的存在对侧延伸空腔的形成至关重要。而且该空腔只在5-HT2家族受体中形成，因为其他胺类受体在238位置上为丙氨酸、丝氨酸、半胱氨酸或苏氨酸，而这些氨基酸的侧链阻止了空腔的形成。
在受体与配体结合的过程中，5-HT2A受体由非激活状态向激活状态转变，其跨膜螺旋结构的TM3、TM5-7和ECL2均参与与配体的结合。在5-HT2A受体的激活状态下，TM5和TM6会发生主要的构象变化，TM5向内移动，ICL2发生螺旋状转折。5-HT2A受体激活表现为3个特征[5]：第一个特征是NPXXY基序中残基发生内移；第二个特征是E/DRY基序中的侧链发生重排；第三个特征是PIF基序中的侧链发生旋转和移动。
2 不同配体与5-HT2A受体对接模式分析在5-HT2A受体与激动剂的对接研究中，通过2，5-二甲氧基-4-碘苯丙胺(2，5-dimethoxy-4-iodoamphetamine，DOI)和麦角酰二乙胺(lysergic acid diethylamide，LSD)与5-HT2A受体的分子对接发现[6]，TM3、TM5-7、ECL2和ECL3均与配体产生相互作用。配体与Ser159、Ser239形成氢键相互作用，与Phe339、Phe340、Val235等位点形成疏水相互作用。在5-HT与5-HT2A受体的结合模式中，5-HT与Asp155形成盐桥，与Phe340和Phe339形成疏水相互作用，与Asn343和Ser242位点形成氢键作用，以此来保持与受体的稳定结合[7]。
在5-HT2A受体与反向激动剂的研究中[4]，通过利培酮和佐替平与5-HT2A受体的结合模式发现配体与Asp155形成盐桥，与Tyr370形成氢键作用，利培酮的氟苯异恶唑环和佐替平的苯环位于底部疏水裂隙中，与Ser159形成CH-π相互作用，与Ile163、Phe243和Phe332形成疏水相互作用，与Trp336和Phe340形成π-π相互作用。在5-HT2A受体与拮抗剂的对接研究中[7]，拮抗剂酮色林和氟哌啶醇与TM3、TM5-7和ECL2结合，并与残基Phe339、Phe340、Ser159、Tyr370、Leu229和Asp155产生相互作用。Phe339和Phe340参与与配体的疏水相互作用，并且还发现在5-HT类受体中是保守的。残基Ser159与配体酮色林形成氢键，与拮抗剂结构中芳香环相连的卤素通常锚定在Ser159和Tyr160所在的TM3和TM5之间。
因此，5-HT2A受体与不同配体的对接研究[8-10]，发现激动剂与反向激动剂与受体相互作用存在一个共同的机制，即TM3、TM5-7和ECL2均会与配体产生相互作用，其中配体与位点形成的相互作用也大致相同，不同的是反向激动剂与Trp336和Phe340这两个位点形成的是π-π相互作用。
3 5-HT2A受体关键氨基酸位点的功能分析通过对受体氨基酸序列和GPCR激活与非激活状态模型的分析，根据同源建模、分子动力学模拟的理论，许多文献都提出了关于5-HT2A受体上关键氨基酸位点结构和功能作用的假设，并通过定点突变实验验证能够影响受体相关功能的关键氨基酸位点且进一步分析决定相应配体亲和力、效能、特异性和偶联效率等的分子机制。
3.1 与5-HT2A受体结构相关的氨基酸位点跨膜螺旋结构作为5-HT2A受体的一个主体结构，其由于中间环和侧链之间的非共价相互作用而维持在基础状态，而结构域中某些氨基酸位点发生变化会破坏这一稳定状态，导致跨膜螺旋结构域发生移动，使受体构象状态发生变化，进而影响受体活动和其他相关功能[11]。
5-HT2A受体在没有配体结合状态下通过受体TM6胞内部分产生的离子作用力和疏水作用来保持稳定的非激活状态，TM6上的Glu318和位于TM3上的Arg173间强烈的离子作用力被认为是保持5-HT2A受体结构基础状态的主要因素[12]。因此推测此作用位点的突变能够引起受体构象的改变，增加受体活性。氢键的正常形成也是受体构象转变的关键因素之一，通过位点突变实验显示，TM2区域上Asp120和TM7区域上的Asn376构成的氢键结合网络是5-HT2A受体激活所必须的，使用丙氨酸替代任一位点的氨基酸都导致受体活性的改变[13]。有研究发现，Pro288的存在可能增加5-HT2A受体中TM5的灵活性，使不同的激动剂与受体的跨膜螺旋的不同构象相互作用[14]，因此作用于此位点的突变，可能影响5-HT2A受体的配体选择性与结合效率。有研究人员在LSD与5-HT2A受体结合的复合物中发现，LSD的二乙胺部分与5- HT2A受体ECL2中的Leu229形成特异性相互作用是LSD在受体中长时间停留的一个关键驱动因素[5]。另外，5- HT2A受体与人特异性残基Ser242的特异性相互作用也介导LSD从人5-HT2A受体缓慢分离。
3.2 与5-HT2A受体功能相关的氨基酸位点 3.2.1 影响受体选择性的氨基酸位点由于5-HT2A受体与其他5-HT亚型受体如5-HT2C、5-HT2B受体等具有极高的同源性和序列相似性，所以作用于5-HT2A受体的药物也会对其他受体产生一定作用。对5-HT2A、5-HT2B和5-HT2C受体进行比较分析发现，5-HT2A受体在TM5区域的相应位置为Ser159，而5-HT2B和5-HT2C受体在这个位置为丙氨酸[14]。因此可尝试利用这种差异去设计选择性配体，如利用此位置氨基酸性质的不同，设计改造配体能与5-HT2A受体的丝氨酸形成氢键或其他相互作用，而不对5-HT2B、5-HT2C受体上的丙氨酸产生作用，以此提高药物对5-HT2A受体的选择性。
2013年，有研究证实了Ser242位点为5-HT2A受体的关键性氨基酸位点，该研究利用新型药物4-苯基-2-二甲基氨基四氢大麻酚(4-phenyl-2-dimethylaminotetralin，PAT)进行突变实验发现，Ser242突变改变了PAT类药物对5-HT2A受体的亲和力和效能[15]。PAT类药物的特征之一是相比于其他5-HT2A受体配体来说，它拥有较高的5-HT2A受体选择性而对5-HT2B、5-HT2C受体的亲和力较低，所以推测Ser242位点也与5-HT2A、5-HT2C、5-HT2B受体的选择性相关。2016年，匹莫范色林(Pimavanserin)被批准用于治疗帕金森病精神病的药物，匹莫范色林对5-HT2A受体的选择性比5-HT2C受体高40倍，而对其他胺类受体，包括5-HT2B受体的亲和力非常低。在其与5-HT2A受体的分子对接研究中发现，Gly238突变体显著降低了与受体的亲和力和拮抗活性，而在5-HT2B受体和5-HT2C受体中，由于形成的侧腔太浅不能容纳匹莫范色林的异丁氧基苄基，这表明5-HT2A受体的侧腔的存在是匹莫范色林高选择性的原因之一[4]。
3.2.2 影响G蛋白偶联的氨基酸位点不同GPCR能与不同的G蛋白偶联，同一受体也能偶联不同的G蛋白，从而引发一系列下游信号，产生不同或相似的效应。激活5-HT2A受体最显著的作用之一即为幻觉的产生，5-HT2A受体被认为是介导5-HT能致幻剂产生致幻作用的主要受体[16]。研究表明，致幻剂麦司卡林、LSD主要作用于5-HT2A受体，会引起幻觉产生、知觉、意识、情绪等的改变。然而，麦角乙脲、伊博格碱类似物(tabernanthalog，TBG)[17]等药物同样激动5-HT2A受体，却不引起幻觉的产生，致幻与非致幻性5-HT2A受体激动剂都作用于同一受体却产生不同的生理效应，推测可能是与这两类药物介导受体偶联不同的G蛋白相关。因此，研究5-HT2A受体偶联G蛋白的选择性，能够有助于减少5-HT2A受体激动剂的致幻以及其他引起知觉改变的功能，并进一步利用其治疗效应，研发与焦虑症、精神分裂症、酒精尼古丁成瘾等相关疾病的新型药物。
近期一项研究从解析致幻剂与5-HT2A受体的复合物结构出发[18]，发现5-HT、赛洛西宾、LSD和麦角乙脲在与5-HT2A受体的结合中采用两种不同的形式，LSD和麦角乙脲与5-HT2A受体主要结合在正位结合口袋(orthosteric binding pocket，OBP)底部以及扩展结合口袋(extended binding pocket，EBP)。而相比之下，5-HT和赛洛西宾主要与受体的EBP接触。对OBP附近的关键残基Ser239和Ser242以及EBP附近的关键残基Trp151和Leu362进行位点突变，突变后配体的激动活性均降低。其中，研究人员发现Leu362的突变不影响配体激活Gq信号的效力，但会取消赛洛西宾和麦角乙脲激活β-arrestin信号的能力，即处于EBP中的Leu362位点是影响配体偏向性的关键氨基酸位点，可以根据此位点设计G蛋白偏向性化合物。
影响G蛋白偶联的选择性因素，被认为与细胞内结构域密切相关，特别是ICL2和ICL3的相关位点对于确定偶联的选择性起重要作用[19]。通过分析胞内G蛋白特定偶联位点发现，5-HT2A受体上Phe340突变后，只轻微影响与DOM的结合能力，却显著改变了药物作用的效能[20]。除Phe340之外，Ser239可能为另一个与G蛋白偶联相关的重要氨基酸位点，将其丝氨酸突变成丙氨酸后，用LSD激动5-HT2A突变型受体，发现其亲和力水平无明显改变，而效能降低约3倍[21]。但有趣的是，当使用DOI作用于Ser239突变体时，在其亲和力增加的同时却对DOI的效能无明显影响[22]，DOI与LSD作用于相同突变体而引起的功能改变的不同，这可能是由与配体结构不同所导致的。高度保守的酪氨酸Tyr370在与不同激动剂结合中具有重要的作用，但在机制上是不同的，Tyr370的突变对5-HT和DOM与受体的亲和力大大降低，但对α-甲基-5-羟色胺(alpha-methyl-5-HT)或蟾毒色胺(bufotenine)却没有影响。此外，Trp76、Asp120、Trp200、Trp336、Trp367、Tyr370等位点通过位点突变实验皆发现，在激动剂的作用下，亲和力不变而激动剂活性改变，提示以上位点也可能与G蛋白的偶联相关[20]。
以上主要综述了根据对分子动力学和分子对接模拟显示的可能影响5-HT2A受体结构的氨基酸位点，以及通过位点突变实验得到的影响5-HT2A受体相关配体亲和力和功效的氨基酸位点。
4 总结与展望本文主要阐述了5-HT2A受体的基本结构和相关功能与某些关键氨基酸位点的关系，主要先从以下两方面叙述了与5-HT2A受体功能与结构相关的氨基酸位点：一是根据分子动力学、分子对接模拟所示的可能影响5-HT2A受体功能的氨基酸位点；二是经位点突变实验所得对5-HT2A受体的功能产生影响的氨基酸位点，而该部分关键性氨基酸位点又可分为影响受体选择性、影响G蛋白偶联等各个方面。5-HT2A受体作为一个具有多种功能的受体，与许多病理生理过程密切联系，是相应精神疾病的重要研发靶点之一。目前普遍的关于5-HT2A受体结构与功能的应用主要研究受体上某些关键性氨基酸位点对于某个或某一类配体的功能影响。通常情况下即使用分子动力学模拟以及分子对接等方法寻找氨基酸位点，并采用位点突变和功能实验来验证氨基酸位点对作用于5-HT2A受体药物的亲和性和效能等的重要性。而上述内容能够帮助我们深入研究与5-HT2A受体功能相关的关键性氨基酸位点，并帮助我们进一步理解5-HT2A受体的结构与功能的相关联系以及结构的动态变化所导致的功能差异，并据此作为新的研发思路以指导新药设计和相关精神疾病的研究。此外，已有的与5-HT2A受体功能研究的相关资料着重于研究其本身的关键氨基酸位点，但是5-HT2A受体还可与其他受体发生相互作用形成异源二聚体[23]，这提示进一步研究与5-HT2A受体形成异源二聚体的相应受体的关键氨基酸位点对于5-HT2A受体的功能研究也具有一定的重要意义。
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